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【摘要】 目的 探讨儿茶素的主要成分L-表没食子基儿茶素没食子酸酯（L-EGCG）对脂蛋白(a)［Lp(a)］诱导的大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)增生影响及可能机制。 方法 选定最佳剂量与最佳时间将GMCs分为对照组、Lp(a)组［Lp(a)(5.0μg/ml)］、L-EGCG组［Lp(a)(5.0μg/ml)+ L-EGCG(200mg/L)处理］共三组分瓶培养。观察L-EGCG对GMCs增生率(MTT)、增生细胞核抗原(PCNA)阳性表达率及培养液上清的细胞间粘附因子-1(ICAM-1)浓度的影响，并与对照组相比较。 结果 在对照组、Lp(a)组及L-EGCG组，随着处理时间的延长，GMCs的MTT、PCNA、上清ICAM-1浓度呈增加趋势，经F检验，差异有统计学意义（P<0.01）。与对照组比较，应用Lp(a)5.0g/ml处理后，在不同的处理时间，Lp(a)组MTT计数、PCNA阳性率、ICAM-1均明显增高，经两两之间的q检验，差异有统计学意义（P<0.01）。与Lp(a)组比较，应用L-EGCG处理Lp(a)诱导的大鼠GMCs，在不同的处理时间，L-EGCG组MTT计数、PCNA阳性率、ICAM-1均明显降低，经两两之间的q检验，差异有统计学意义（P<0.01）。在Lp(a)组、L-EGCG组，培养上清ICAM-1浓度与PCNA阳性率及与反映系膜细胞增生指标的MTT呈正相关。 结论 Lp(a)能明显促进肾脏GMCs的增生，L-EGCG可明显抑制Lp(a) 诱导的大鼠GMCs增生，此可能与影响ICAM-1表达有关。
【关键词】 L-表没食子基儿茶素没食子酸酯；脂蛋白（a）；系膜细胞；细胞间粘附因子-1；增生细胞核抗原；大鼠
Effects of L-EGCG on proliferation glomerular mesangial cells of rat model induced by lipoprotein (a).
XIANG Wei, HE Xiao-jie, XIE Hui-neng, et al.
Department of Peadiatrics, Hainan Provincial People’s Hospital, Haikou 570311, Hainan,P. R. China
Abstract：Objective To investigate the effects of L-epigallocatechins gallic acid ester（L-EGCG） on proliferation of glomerular mesangial cells (GMCs) of rat model induced by lipoprotein (a)［Lp(a)］ and explore the possible mechanism of L-EGCG on the proliferation of rat GMCs by Lp(a). Methods Rat GMCs were divided into three groups: control group, Lp(a)(5.0μg/ml) group, Lp(a)(5.0μg/ml) + L-epigallocatechins gallic acid ester (L-EGCG 200mg/L) group. After culture (at the end of 12h, 24h, 48h, 60h and 72h), collecting the cultured GMCs and suspension to observe the rate of GMCs proliferation(MTT), the positive rate of proliferation cell nuclear antigen (PCNA) (immuno-histo-chemisty), and to detect intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) activity(ELISA). Results At the end of experiment, MTT, the positive rate of PCNA and ICAM-1 activity of GMCs were increased as culture time increased in three group. Compared with control group, MTT, positive rate of PCNA and ICAM-1 activity of GMCs were more significantly enhanced in Lp(a) group. Compared with Lp(a) group, MTT, positive rate of PCNA and ICAM-1 activity of GMCs were significantly decreased in Lp(a)+L-EGCG group. ICAM-1 activity showed positive correlationship with MTT and the positive rate of PCNA. Conclusion Lp(a) can significantly affect the rate of GMCs proliferation. L-EGCG can depress proliferation GMCs of rat model induced by Lp(a) and correct with ICAM-1.
Key words：L-epigallocatechins gallic acid ester; lipoprotein(a); glomerular mesangial cells; intercellular adhesion molecule-1; MTT ; proliferationg cell nuclear antigen; rat
小儿原发性肾小球疾病是临床上常见疾病之一，如其肾小球病变不断加重，最终可导致肾小球硬化、肾功能丧失。肾小球硬化的发病机理仍未明，目前认为主要与肾小球固有细胞（如系膜细胞、内皮细胞等）及肾脏局部浸润的巨噬细胞生物学行为变化，引起包括细胞因子的产生、细胞凋亡以及细胞外基质降解酶活性的改变等有着十分密切的联系。大量研究表明肾小球系膜细胞（Glomerular mesangial cells, GMCs）增殖与肾小球硬化密切相关［1］。已知多数肾脏疾病伴随脂代谢紊乱，且脂质异常能引起或加重肾损伤，是肾小球病变进展的重要危险因素之一［2］。
脂蛋白(a)［Lipoprotein(a),Lp(a)］是一种特殊类型的脂蛋白，是冠心病、动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）的独立危险因素，我们既往研究发现难治性肾病综合征患儿存在血脂代谢紊乱及载脂蛋白E基因多态性的异常，且与Lp(a)相关联［3］。亦有研究发现Lp(a) 对体外培养的人系膜细胞增殖、移行、黏附有明显影响［4］。
绿茶具有多种重要的生物学功能，如抗氧自由基、抗细胞凋亡、抗肿瘤、调节免疫等等，L-表没食子基儿茶素没食子酸酯（L-epigallocatechins gallic acid este,L-EGCG）为其主要活性成份，研究表明L-EGCG是一种重要的非酶抗氧化剂，能上调内源性抗氧化酶的活性，清除活性氧，减少MDA，保护DNA链免受损伤［5］。但L-EGCG对Lp(a)影响GMCs增生的作用及其可能机制尚未见报告。
1 材料和方法
1.1 材料
大鼠GMCs, LP(a), L-GGCG由美国Sigma公司生产。前期研究发现L-GGCG对GMCs增生最佳抑制浓度为200mg/L，本研究采用L-EGCG 200mg/L进行干预［6］。
1.2 方法
1.2.1 大鼠GMCs培养［7］
从液氮罐内取出大鼠GMCs系冷冻管，37℃温水水浴后离心，吸出细胞液，移入细胞培养瓶静置培养，培养液由20%胎牛血清、0.3U/ml胰岛素、100U/ml青霉素、100 mg/L链霉素、2.5mg/L二性霉素及D-缬氨酸改良的伊格尔培养基（Minimum Essential Medium，MEM）组成。培养瓶置于5% CO2、18%O2孵箱内。当GMCs长至贴壁时，用0.25%胰蛋白酶与0.04%乙二胺四乙酸二钠等量混合，消化细胞，传代。笫3代时，用RPMI 1640代替D-缬氨酸改良的MEM，其他成分相同。
1.2.2 Lp(a)分离
通过采用肝素体外LDL沉淀法定期进行LDL血浆置换患者的富含Lp(a)再生液，行超速离心（密度1.065-1.120mg/ml），再予密度梯度离心法分离。获取的 Lp(a) 经 150mmolNaCl、1mmol/L EDTA（pH 7.4）于4℃透析48h后，微孔过滤膜除菌，Sephader G 25M 凝胶层析和赖氨酸-seppharose 4B层析纯化，采用0.6%琼脂糖凝胶电泳和4%的SDS-PAGE鉴定并分析纯度。储存备用。既往我们研究发现Lp(a)5.0μg/ml可引起GMCs明显增生，故此研究采用Lp(a)5.0μg/ml处理GMCs。
1.2.3 MTT法测定大鼠GMCs增生率［6］
将GMCs种入96孔板中，（2～4）×104个细胞/孔，分为对照组、Lp(a)组、L-EGCG组［Lp(a)+L-EGCG处理］。Lp(a)终浓度为5.0μg/L，L-EGCG处理组采用儿茶素主要成分L-EGCG 200mg/L进行干预。分12h、24 h、48 h、60h、72 h 5个时间段分别测定GMCs增生率。细胞增生率=（LPS组吸光度-实验组吸光度）/ LPS组吸光度。
1.2.4 GMCs中增生细胞核抗原（Proliferationg cell nuclear antigen，PCNA）表达的测定［6］
GMCs分瓶培养，实验末，收集培养细胞，涂片，丙酮固定，免疫组化法测定PCNA表达。实验结果在显微镜下观察，分别计数每张涂片中的5个视野内（200个/每视野）GMCs的免疫染色阳性细胞数，计算其阳性率。
1.2.5 细胞间粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）的测定
采用ELISA法（试剂盒购自南京建成生物工程有限公司）。
1.3 统计学分析
采用SPSS-8.0统计软件包进行统计学处理，所有资料均采用x±s表示，时间-剂量效应采用因方差分析进行统计处理，多组资料间和同组多个时点资料间比较，方差齐者，采用One-Way ANOVA分析，组间两两比较采用LSD法，方差不齐者采用Tamhane分析，对有相关趋势的变量采用Pearson相关分析：以α=0.05（two tailed）作为检验标准，P<0.05为差异有显著意义。
2 结果
2.1 L-EGCG对Lp(a)诱导的GMCs增生率(MTT计数)的影响
从表1可看出，在对照组、Lp(a)组及L-EGCG组，随着处理时间的延长，GMCs增生率有明显增加，48h时，细胞已达到对数生长期峰值，其后进入生长平台期。在不同的处理时间，在对照组、Lp(a)组及L-EGCG组，GMCs增生率均有明显变化，经F检验，差异有统计学意义（P<0.01）。表1 L-EGCG对Lp(a)诱导的GMCs增生率(MTT计数)的影响（略）
与对照组比较，应用Lp(a)5.0g/ml处理后，12h、24h、36h、48h、60h、72h Lp(a)组MTT计数均明显增高，经两两之间的q检验，差异有统计学意义（P<0.05）。
与Lp(a)组比较，应用L-EGCG处理Lp(a)诱导的大鼠GMCs，发现12h、24h、36h、48h、60h、72h，L-EGCG组MTT计数均明显降低，经两两之间的q检验，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.2 L-EGCG对Lp(a)诱导的GMCs增生细胞核抗原阳性表达率(PCNA)的影响
从表2可看出,从时间效应来看，在对照组，随着处理时间的延长，PCNA阳性率逐渐增加。在Lp(a)组，随着处理时间的延长，PCNA阳性率渐增加，但在60h、72h，PCNA阳性率逐渐下降。在L-EGCG组，随着处理时间的延长，PCNA阳性率呈增加趋势，在24h、36h、48h进入一相对平台期，60h再度增加，72h与60h无明显变化。在不同的处理时间，在对照组、Lp(a)组及L-EGCG组，PCNA阳性率均有明显变化，经F检验，差异有统计学意义（P<0.01）。表2 L-EGCG对Lp(a)诱导的GMCs增生细胞核抗原阳性表达率(PCNA)的影响（略）
与对照组比较，应用Lp(a)5.0μg/ml处理后，12h、24h、36h、48h、60h、72h， PCNA阳性率均明显增高，经两两之间的q检验，差异有统计学意义（P<0.01）。
与Lp(a)组比较，应用L-EGCG处理Lp(a)诱导的大鼠GMCs，发现12 h L-EGCG组PCNA阳性率降低，但差异无统计学意义（P>0.01），24h、36h、48h、60h、72h，L-EGCG组PCNA阳性率均明显降低，经两两之间的q检验，差异有统计学意义（P<0.01）。
2.3 L-EGCG对Lp(a)诱导的GMCs培养上清ICAM-1水平的影响
从表3可看出，从时间效应来看，在对照组，随着处理时间的延长，培养上清ICAM-1水平逐渐增加，72h较60h下降。在Lp(a)组，随着处理时间的延长，培养上清ICAM-1水平渐增加，但在48h、60h、72h，培养上清ICAM-1水平无明显变化。在L-EGCG组，随着处理时间的延长，24h培养上清ICAM-1水平较12h明显下降，36h后培养上清ICAM-1水平逐渐增加，经F检验，差异有统计学意义（P<0.01）。表3 儿茶素对Lp(a)诱导的GMCs培养上清ICAM-1水平的影响（略）
在不同的处理时间，在对照组、Lp(a)组及L-EGCG组，培养上清ICAM-1水平均有明显变化，经F检验，差异有统计学意义（P<0.01）。
与对照组比较，应用Lp(a)5.0μg/ml处理后，12h、24h、36h、48h、60h、72h， Lp(a)组培养上清ICAM-1水平均明显增高，经两两之间的q检验，差异有统计学意义（P<0.01）。
与Lp(a)组比较，应用L-EGCG处理Lp(a)诱导的大鼠GMCs，发现12h、24h、36h、48h、60h、72h，L-EGCG组培养上清ICAM-1水平均明显降低，除72h外，余经两两之间的q检验，差异均有统计学意义（P<0.01）。
2.4 相关性分析
从时间效应来看，在Lp(a)组、L-EGCG组，培养上清ICAM-1浓度与PCNA阳性率及与反映GMCs增生指标的MTT呈正相关［在Lp(a)组，12h、24 h、36h、48 h、60h、72h时间段，相关系数分别为0.96、0.85、0.95、0.94、0.97、0.92、0.98、0.90、0.99、0.93、0.96、0.94，P<0.01；在L-EGCG组，相关系数分别为0.94、0.94、0.72、0.46、0.90、0.89、0.43、0.58、0.42、均<0.01］。
3 讨论
大量研究发现，由于体内部分调节因素的失调，多数肾脏疾病常常伴随明显的脂质代谢紊乱，存在各种类型的脂质代谢异常。有人甚至将存在脂质异常的肾脏疾患命名为脂质性肾炎，以强调脂质异常与肾脏疾病发病之间特有的关系。早在1860年，Virchow在描述Bright‘s肾病时就提及“脂质变性”，1982年Moorhead基于Munk等近近20位学者的研究结果，于柳叶刀(LANCET)中以假说的形式,在题为“慢性进行性肾小球和小管一间质疾病中的脂质肾毒性”中明确地提出“脂质”具“肾毒性”，此后血脂异常与肾脏损害相关性的研究，得到国内、外研究者的重视，并广泛而深入地开展起来，从而认识到肾脏是继心、脑血管之后，遭受血脂异常危害的另一个靶器官［8］。
肾小球硬化、肾功能丧失是肾脏疾患发展的终末阶段，近年来研究表明肾小球硬化与AS在组织形态上的改变及发病机制上存在相似性。肾小球硬化可以认为是AS过程在肾小球毛细血管的延伸，而导致以系膜区泡沫细胞聚集、系膜基质过度增生为特征的结构改变及功能紊乱。在儿科终末期肾病患者，已发现AS的亚临床证据，在动脉内膜出现斑块，在肾移植患儿，髂动脉活组织检查发现AS病变［9］。
Lp(a)是1963年由Berg利用免疫方法发现的一种新的脂蛋白，其密度在低密度脂蛋白和高密度脂蛋白之间，为1.050～1.100g/ml。Lp(a)与低密度脂蛋白相比，在化学结构上十分相似，含有类似的脂质核心和载脂蛋白B，但比低密度脂蛋白多含一个载脂蛋白(a)，二者之间以二硫键结合，此在其他任何脂蛋白中都不存在。Lp(a)的密度比低密度脂蛋白大（1.065g/ml），颗粒也稍大（25.0nm），Lp(a)与低密度脂蛋白不一样，不是由中间密度脂蛋白在肝脏内转化而来，也不能转化为其他的脂蛋白，系一类独立的脂蛋白［10］。Lp(a)已被认为是心脑血管AS及动脉再狭窄的独立危险因素，Lp(a)和纯化的载脂蛋白(a)可促进平滑肌细胞生长，而此为AS病灶产生的重要事件之一。并且Lp(a)对血液纤维蛋白的溶解有一定影响，Lp(a)可明显增加α-抗纤维蛋白溶解酶的抑制作用，而间接影响纤维蛋白溶解酶原的活性，有促血栓形成的作用，估计也参与了AS的形成。血浆Lp (a) 水平升高是肾脏疾病和终末期肾病的共同特征，并加速肾功能的丧失，提示Lp(a)可能与肾脏疾病的发生发展密切相关［10］。
MTT是目前检测细胞增生程度的一种常用方法，代表与实验前相比细胞增生了多少。PCNA是一种细胞周期调控蛋白，是细胞增殖时所需要的DNA聚合酶辅助蛋白，通常用来作为判断肾脏疾病细胞增生的标志物，也是反映细胞增生的一种指标，与MTT结合能更准确的反映细胞增生程度。另一方面，PCNA其本身也参与对细胞周期调控。我们研究发现与对照组比较，Lp(a)组MTT计数及PCNA阳性率均明显增高，提示Lp(a)能明显影响肾脏GMCs的增生，作用呈时间依赖性，进一步证实脂质具有肾毒性。
研究发现增生的GMCs产生细胞粘附分子、巨噬细胞趋化蛋白-1，细胞因子大量单核细胞在肾小球系膜浸润，浸润的单核细胞释放各种细胞因子刺激GMCs增生，系膜区细胞数增加形成泡沫细胞，GMCs通过 LDL受体和清道夫受体介导脂质的吸收。炎症因子增强LDL受体介导脂质摄取；通过增强固醇调节元件结合蛋白的炎症因子过度表达；引起固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白在细胞器间的异常转位；导致GMCs胞内脂质聚集、泡沫细胞形成［11］。
粘附分子是细胞活化产生的一种重要的因子。细胞粘附分子是一类能介导细胞间以及细胞与细胞外基质粘附的糖蛋白，ICAM-1是其中重要的一种，研究发现粘附分子及其粘附机理可能是介导肾炎时细胞浸润和增殖、细胞外基质扩张乃至肾小球硬化的分子基础，已有研究发现肾小球系膜细胞能表达ICAM-1，且许多因素能影响其表达［12］。
我们研究发现Lp(a)明显影响大鼠GMCs 的ICAM-1表达，GMCs上清的ICAM-1浓度与MTT和PCNA阳性表达率呈正相关，与对照组比较，Lp(a)组上清ICAM-1浓度明显增高。既往有研究发现高胆固醇血症和高甘油三酯血症患者血可溶性ICAM-1水平明显升高，人冠状动脉粥样硬化斑块及肾小球MC表面有低表达的ICAM-1［13～14］。说明Lp(a)可能通过ICAM-1而影响系膜细胞增生。
儿茶素是茶多酚的主要活性成分，茶多酚是天然植物中提取出来的一种天然的多酚基次生代谢物。具有强大的抗氧化活性。儿茶素主要是由L-表没食子基儿茶素没食子酸酯（L-EGCG）、L-表儿茶素没食子酸酯（L-ECG）、L-表没食子儿茶素（L-EGC）四种成分组成，而L-EGCG又是儿茶素的主要成分，还原电位最高，抗氧化能力最强。已有研究发现儿茶素有抗AS、降血脂（包括肾病综合征高脂血症）的作用［15～16］。
我们研究发现与Lp(a)组比较，应用L-EGCG处理Lp(a)诱导的大鼠GMCs，随着处理时间的延长，L-EGCG组MTT计数、PCNA阳性率均明显降低，经统计学处理，差异有显著性。表明L-EGCG可明显抑制Lp(a) 诱导的大鼠GMCs增生。
而且我们进一步研究发现应用儿茶素的主要成分L-EGCG处理Lp(a)诱导的大鼠GMCs，随着处理时间的延长，ICAM-1均明显降低，经统计学处理，差异有显著性。且GMCs培养上清ICAM-1浓度与PCNA阳性率及与反映GMCs增生指标的MTT呈正相关。提示L-EGCG抑制Lp(a) 诱导的大鼠GMCs增生亦可能与影响ICAM-1表达有关。
我们研究发现Lp(a)能刺激GMCs增殖，但目前临床上对于高Lp(a)血症尚无理想的治疗方法。本研究发现L-EGCG可明显抑制Lp(a) 诱导的大鼠GMCs增生，提示L-EGCG有抗脂质肾毒性的作用，此也可为肾脏疾病的治疗甚至可能对高Lp(a)血症治疗产生一定影响。
【参考文献】
［1］易著文. 实用小儿肾脏病手册［M］. 北京:人民卫生出版社,2005，10～17.
［2］向伟. 小儿血脂异常-基础与临床［M］. 北京:人民卫生出版社,2001，435～440.
［3］向伟,易著文,曹燕,等. 难治性肾病综合征患儿载脂蛋白E基因多态性的研究［J］.中华肾脏病杂志,2000,16(2):123～124.
［4］许可,宋红梅,魏珉.脂蛋白(a) 对体外培养的人系膜细胞增殖、移行、黏附的影响［J］.中华儿科杂志,2004,42(10):734～737.
［5］陈伟光. 茶色素的药理和临床研究［J］. 药学进展, 2000, 24(6): 341～344.
［6］何小解,卢向阳,易著文.L-EGCG对脂多糖诱导的大鼠系膜细胞增生影响［J］.湖南医科大学学报,2003,28(3):281～284.
［7］孙晓艳,安靓,傅博,等.肾小球系膜细胞的分离和培养［J］.第一军医大学学报,2003,23(08):795～797.
［8］Krane V, Wanner C. Dyslipidaemia in chronic kidney disease. Minerva Urol Nefrol. 2007,59(3):299～316.
［9］Nayir A, Bilge I, Kilicaslan I, et al. Arterial changes in paediatric haemodialysis patients undergoing renal transplantation［J］. Nephrol Dial Transplant, 2001, 16:2041～2047.
［10］赵水平.临床血脂学［M］.北京:人民卫生出版社，2006,108～114.
［11］李英,刘茂东.肾脏系膜细胞在慢性肾脏病进展中的作用［J］.国际移植与血液净化杂志,2007,5(4):15～17.
［12］Satriano JA,banas B, Luckow B, et al. Regulation of RANTES and ICAM-1 expression in murine mesangial cells［J］. J Am Soc Nephrol, 1997,8(4):596～603.
［13］Karaduman M, Sengul A, Oktenli C, et al. Tissue levels of adiponectin, tumour necrosis factor-alpha, soluble intercellular adhesion molecule-1 and heart-type fatty acid-binding protein in human coronary atherosclerotic plaques［J］. Clin Endocrinol (Oxf) , 2006,64(2):196～202.
［14］郭志勇,梁嘉靖,崔若兰.细胞因子对肾小球系膜细胞表面表达细胞间粘附分子1的影响［J］.第二军医大学学报,1998,19(3):289～290.
［15］朱达泉,沈洪兵,黄淑仪,等. 茶叶提取物降血脂作用的临床流行病学研究［J］. 江苏医药, 1998, 24(10):737～738.
［16］Imai K, Nakachi K. Cross sectional study of effects of drinking green tea on cardiovascular and liver disease［J］. BMJ, 1995, 310:18～26.