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【摘要】 以PCR为基础的HPV检测方法在宫颈癌的筛查和检测中具有特异性强、灵敏度高等多种优点，具有其他方法难以替代的优势，因此它在宫颈癌的筛查和治疗中有着重要的临床价值。本文简要介绍了宫颈癌与HPV的常规筛查方法﹑核酸杂交检测法﹑以PCR为基础的HPV检测方法等内容，并列举了一些PCR检测技术在宫颈癌筛查和治疗中的应用及临床价值。
【关键词】 人乳头瘤病毒（HPV）；以PCR为基础的HPV检测法；分型检测；杂交分析
近年来的研究发现人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus，HPV）有多种基因型（也称亚型），已有 120 多个亚型被确定，其中约有 40 种涉及生殖道感染，约 20 余种与肿瘤有关。HPV可引起乳腺癌、肛门癌、阴茎癌、女阴癌和宫颈癌，尤其是宫颈癌，90％～95％与HPV感染相关，已受到人们的极大关注。宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性恶性肿瘤中占第二位，仅次于乳腺癌。据世界范围内的统计，每年大约有50万新发的宫颈癌病例，其中80％的病例发生在发展中国家.我国宫颈癌患病率和病死率均约占世界的1／3，每年新增宫颈癌患者13.15万，约有5万例死于宫颈癌［1］ 。
宫颈癌早期症状不明显，筛查预警对早期发现宫颈癌，降低死亡率极为重要。目前HPV的诊断完全依赖于临床标本中HPV-DNA的检测。另外不同的HPV基因型有着不同的致癌性，因而HPV-DNA 的检测和分型对宫颈癌及女性生殖道肿瘤的病因学和癌前预报具有重要的意义。核酸杂交和基于PCR技术的方法为目前应用最为广泛的HPV检测手段。
1 宫颈癌与HPV的常规筛查方法
目前宫颈癌的筛查主要是基于细胞学的检测方法，有宫颈巴氏（Pap）涂片、阴道镜活检、液基薄层细胞学或薄片制备细胞学检查（TCT）等多种。宫颈巴氏涂片是群体筛查的常规手段，但受取材、涂片制作质量、阅片技术影响，准确性低，假阳性率高，重复性差，敏感性也有限，漏诊率可达30%。TCT法大大改进了细胞学检查的准确性，逐渐取代传统的巴氏法。可观察宫颈上皮血管微小变化的阴道镜检查虽敏感、准确，但会引起不适、操作不便、费用高，不易为广大患者接受。宫颈组织活检有创伤，不利于人群普查。另外，HPV 检测简理易行，标本可由医生采集或患者自取，是对细胞学检测方法的重要补充。
Mandelblatt等［2］研究显示，每2～3年单独检测HPV用于宫颈癌筛查，与传统的单独巴氏涂片细胞学检查有同样的特异性，且更敏感、更经济。已经证明醋酸后肉眼观察（VIA）和HPV DNA检测显示了优于巴氏涂片的特性，在资源欠缺地区，这些可供选择的筛查方法也比巴氏涂片更符合成本效益的原则。由于宫颈HPV感染多为隐性亚临床感染，且HPV不能在培养环境中稳定生长，大部分HPV感染无临床症状或为亚临床感染但可致严重后果，因此，该感染不能作为一个普通的临床疾病或通过常规筛查计划或性传播疾病调查得以发现，只能通过HPV-DNA检测得知［3］。目前HPV-DNA的检测主要通过应用分子生物学方法，包括核酸杂交方法和聚合酶链反应(PCR)技术［4］。
2 基于HPV-DNA的核酸杂交检测
核酸杂交检测方法主要有核酸印迹法（Southern blot）、原位杂交（In situ hybridization，ISH）、杂交捕获法(HC-Ⅱ、Ⅲ系统)等，各种核酸杂交检测方法有各自的优缺点。核酸印迹法是HPV基因分型的金标准，适用于HPV分型和HPV-DNA分子量鉴定，灵敏度高，但操作复杂，需新鲜组织标本，不便于临床推广。原位杂交通过非放射性探针对石蜡组织进行检测，且能做定位检测，假阳性率低，但灵敏度低［5］，大大降低了临床使用价值。
杂交捕获法（HC-Ⅱ）是利用分子杂交化学发光，使信号放大的原理，是目前惟一通过FDA批准的可在临床使用的HPV DNA检测技术。该技术敏感性较好，重复性高，在美国已作为巴氏法筛查宫颈癌的辅助检查，而且在有些国家已经作为宫颈癌筛查的基本方法，可单独使用或与巴氏法联合使用。目前能一次性精确地检测出18种HPV，其中有13种高危型HPV病毒亚型，包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型，而这13种病毒亚型就是引起宫颈癌的直接原因。HC-Ⅲ是Digene公司生产的新一代捕获杂交法，和HC-Ⅱ一样也用RNA探针，但用一段带有生物素的寡核苷酸代替HC-II中的特异性抗体，将RNA DNA杂交体固定在链霉素包被的孔中。由于这段寡核苷酸与HPV DNA的另一段序列互补，从而减少了非特异性杂交造成的假阳性结果［6］。
但无论是HC-Ⅱ还是HC-Ⅲ最大的缺点是不能测定具体的HPV型别；另外加上专利的因素，使这种方法的研究和发展受到一定限制。
3 基于HPV-DNA的PCR检测法
以聚合酶链式反应(PCR)为基础的检测方法是用PCR方法先进行目的基因的扩增，然后再用各种方法进行检测。这一技术手段的出现给HPV检测的各个方面提供了巨大的发展空间，因为它能在体外扩增特定的DNA基因，PCR提供了在复杂的背景下检测这些片段的十分有用的工具，特别是对病毒感染的检测。目的基因扩增是所有DNA分析技术中最灵活和灵敏的手段，所以目前认为以PCR为基础的检测方法是进行HPV DNA检测及分型的最好方法。它可以应用于检测、病毒负荷定量、DNA测序和突变分析，也可以进行多重扩增，同时分析多个DNA序列。
3.1 HPV-DNA 的PCR扩增 对HPV-DNA 的扩增主要可以分为型特异PCR和普通PCR。
(1)型特异PCR：型特异性PCR法(Type-Specific PCR，TS PCR)是通过具有型特异性的引物，对病变组织提取的DNA 进行特异性扩增，再用凝胶电泳的方法进行检测，然后通过检验阳性条带的扩增结果与扩增效率，从而对HPV感染进行诊断，TS—PCR方法的最关键步骤是引物的设计、选取，不同类型的HPV要选用不同的具有型特异性的引物，针对型间变异最大的区域，通常是E5／E7区，设计成能特定扩增单个HPV基因型。用型特异性PCR后即可确定特定型别的HPV，但这种方法费力，为了检测一个临床样本中HPV DNA的存在，需要分别完成多个型特异的PCR反应。
(2)通用引物PCR：通用引物PCR是使用通用引物来扩增广谱的HPV，引物针对不同HPV型别之间的保守区域。这个保守序列的确定需要来自每个HPV基因型的许多序列。由于在HPV基因组中L1区是最为保守的区，目前一些通常使用的通用引物就针对这个区，如GP5+／6+ (扩增150bp左右)、MY09／11及其改良的PGMY (扩增．150bp左右)、SPF10 (扩增65bp左右)不含简并碱基而含黄嘌呤 ，因黄嘌呤可和任何碱基匹配，故合成的引物具有较好的重复性且PCR可在优化的退火温度下进行，从而提高了其扩增的效率和重复性。在经过甲醛固定、石腊包埋等处理后的标本中，DNA会遭到不同程度的降解，这对产生大片段扩增产物的引物不利，而SPF扩增的片段长仅为65bp，因此提高了扩增的效率（一般来说，PCR效率随着扩增片段的延长而降低）。总的来讲，各引物有各自不同的特性，都能对广谱HPV类型进行检测和分型。以往通用引物也有设在E1区的。为提高普通PCR的敏感性，也常用巢式PCR，如先用MY09／11扩增后用其扩增产物作模板再用GP5+／6+扩增，可检测到较低的病毒含量。
(3)实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR，RQ-PCR)：实时荧光定量PCR可用型特异PCR的功能也可用普通PCR的功能对HPV分型检测，并提供定量的功能。对于HPV的分型检测，一般的实时荧光定量PCR用型特异性引物，相当于型特异PCR，仅多了定量的功能，而以分子信标为基础的实时荧光定量PCR还能同时检测多型HPV［7］。先用尾部带有一段固定寡核苷酸的通用引物进行两轮的预扩增，使引物的尾部序列插入到扩增子中，然后用分子信标和针对尾部序列的引物连在一起的蝎子引物进行扩增，分子信标环上的寡核苷酸作为探针，针对扩增区域内不同型别之间的相同序列部位。目前已设计的两个通用探针可检测4O多种型别的HPV，其作用与HCⅡ相似，可检测一组型别的感染，但不能确定具体型别，可应用于大量样本的筛查。但也有认为用1～2个荧光探针不可能完全检测到所有型别，需要较多探针的混合，但探针的不同特性导致不易标准化。实时PCR闭管操作，可有效消除核酸交叉污染，具有实时、高灵敏度的优点，而且具备定量功能。但用于HPV的分型上，型特异实时PCR的工作量太大，而以分子探针为基础的实时PCR的蝎子引物及探针的有效性需要大量的验证及改良，而且目前实时荧光PCR实验成本比较高，也限制了其广泛应用。
3.2 PCR产物的分型检测 PCR是所有分型方法的通用技术。一旦有一个通用引物，分型检测可用多种方法完成，主要有直接测序法、限制性片段长度多态性分析（RFLP）、杂交法（有LIPA等）以及目前很具影响力的基因芯片法。分型策略如图1。图1 人乳头瘤病毒基因分型方法
Fig 1 Human papillomavirus genotyping strategy (1)PCR产物的直接测序法：直接测序法可以测定PCR产物中的一对引物之间的序列。这种技术对同源性很差的HPV基因型能提供强的序列信息，同时也能提供已知HPV型别的突变信息。经测序后当未识别序列<5％时，可以与GeneBank数据库中的已知序列进行比较确定型别；当与所有已知型别的序列相似性<90％时即可被认为是新的型别。PCR产物直接测序法能检测所有型别，并可以避免杂交反应所固有的交叉反应。对HPV型特异性检测是一种比较可靠的方法，特别是对检测少见型和发现新的型别有着重要的作用，如检测HPV34、53、66、73、82、83等这些不包括在HCⅡ中的型别，这其中有高危型和低危型，也有目前不明其危险性的型别［8］。
但直接测序法对于混合感染中同步检测不同序列的敏感性不高，有时由于混合型别的存在使测序时序列无法读出从而无法判断型别，标本中含量少的型别容易被忽略而仅仅检测到占主导地位的基因型。虽然目前的快速测序法可对临床样本进行高通量的常规检测，但序列分析这一步骤仍相对费时、昂贵。改进PCR中通用引物对各种HPV的扩增效率将有助于不同型别混合存在时的序列分析；同时改进序列分析的分辨能力，尽量减少不能识别的序列将使直接测序法更加实用。
(2)PCR产物的限制性片段长度多态性分析(PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR—RFLP)：限制性片段长度多态方法用于鉴别HPV基因特异性的限制模式源于后PCR通用引物扩增DNA。大多数用于分析的限制性酶是BamHI、DdeI、HaeIII、 HinfI及PstI。不同的HPV有不同的序列，如果在限制性位点上有差异，核酸内切酶则不能识别而不能特异性酶解DNA，从而产生不同的限制性片段，产生不同的电泳条带模式。选择合适的限制性核酸内切酶，或选择几种内切酶的组合，就可以根据特定的条带模式判断HPV的型别。这种方法相对比较简单易行，不需要特殊昂贵的仪器设备，费用低。选择内切酶的最佳组合可以检测HPV的具体型别，特别是可以检测出HCⅡ所不包含的少见的型别，当酶切出现不能判断的条带模式时，结合序列分析可以发现新的型别［9］。用PCR-RFLP的方法产生的条带模式判断型别时，可以设计简单的软件协助判断，从而优化此方法的分型判断。但RFLP对PCR产物的特异性要求比较高，非特异性条带的出现会导致酶切后分型上的不确定性，所以需要扩增目的片段的通用引物的特异性比较高，而且需要优化PCR反应条件，增加目的条带的特异性。
(3)PCR产物的杂交分析：杂交分析是最常用的检测PCR产物序列的方法。型特异杂交法敏感性较高，一次可检测多个PCR产物，并对多重感染的检测能力较高，但其缺点是只能用于检测已知的一定的常见型，对未知型及变异型的HPV不能检测，而且不能排除杂交固有的问题，即有交叉杂交存在的可能性。①微孔板杂交：其具体原理是在PCR引物的5’ 端标记生物素，将PCR产物与包被有亲和素的微孔板结合，并与含荧光素的特异性探针杂交，酶标记抗荧光素抗体与之结合进行显色反应，通过测定其吸光度来判断结果。这种方法的优点是微板模式的高通量和自动化及设备的应用减少了手工劳动时间［10］。所以这作为HPV分子诊断中的第1步，区分HPV阳性和阴性是很合适的，但用特异探针检测每种HPV基因型的鉴定需要大量的PCR产物和各种特异性探针。② 反向杂交：反向杂交中较有名的是线性平行杂交(1ine probe assay，LiPA)，另外还有点杂交(dot blot assay)等。线性杂交分析通过与固定在尼龙膜上的寡核苷酸选择性地杂交。其技术和结果与Western印迹很相似。运用线性杂交分析技术，不同的HPV基因型可高敏感性地分辨出来，达到100-attogram水平。它的过程如下：首先在一个膜条里平行固定了多个探针。然后把用生物素标记的引物扩增目的基因，再把双链的PCR扩增产物在碱性环境下变性后加在上述平行固定的多个探针的膜上，经过杂交和严格的冲洗后，依次加入链霉素生物素复合物和底物，最后根据探针上产生的紫红色沉淀判断相应的型别。这种方法单步即可检测多种HPV型别，而仅需要少量的PCR产物。该方法敏感性高，可检测出混合感染中的各个型别，而且使用单一设计，每张膜上能同时对几十个PCR产物进行分型，目前常用于HPV型别分布的统计研究中［11］。其中SPF10-LIPA法同序列分析和其他的杂交系统相比，其可靠性更高，且也能用于MY09/11扩增产物的HPV基因分型［12］。
(4)基因芯片(Gene chip)，也称为DNA 芯片、DNA 微阵列(DNA microarray)、寡核苷酸阵列(O1igonuc1eotide array)，其原理是采用原位合成或显微点样技术将许多的DNA探针固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现快速、并行、高效的检测。BioMedlab公司(韩国)发展了用基因芯片的HPV 型的检测系统，这个检测系统目前能检测出22型HPV，其中15型高危HPV (16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、69)和7型低危HPV(6、11、34、4O、42、43、44)。基因芯片法可以一次性对大量标本进行检测分析，具有通量高、速度快、信息量大、所需样品少、污染少等特点，解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、通量低的缺点。用基因芯片来诊断HPV，和HCⅡ一样在有细胞异型的妇女管理和宫颈癌的筛查中能起有效的作用。基因芯片的灵敏度和特异性相对其他方法较高，其敏感性(96.％)高于细胞学的敏感性(83.6％)［13］。
基因芯片不仅可用于分型，而且可以对多个型别的混合感染情况同时进行监控，较杂交捕获法更有优势 。虽然目前基因芯片技术成本昂贵，检测的可靠性、实用性还有待于验证，但基因芯片技术对HPV的分型检测有广阔的发展前景。
4 以PCR为基础的检测法在宫颈癌筛查和治疗中的临床价值
4.1 PCR技术HPV-DNA检测在宫颈癌筛查和治疗中的临床价值 综合近年来的一些研究，对于PCR技术检测HPV DNA的作用有以下几方面的认识：
(1)对于难以确定的不典型鳞状上皮细胞（ASCUS）和宫颈脱落细胞轻度病变作进一步的判断，是一种有效的再分类方法，它能将宫颈上皮内瘤变（CIN）从细胞学结果为未确定意义的非典型鳞状细胞/腺细胞（ASCUS/AGUS）中有效地检出，减少了阴道镜下活检明确宫颈癌前病变的数目，推荐临床上应用HPV检测处理可疑涂片。
(2)单独应用或与细胞学方法联合使用进行宫颈癌的初筛，HPV检测方法简单易行，尤其是病人取材HPV检测法，不论是在取样还是检测时均不需要医生的参与，病人按照标准要求操作，将取样器（棉签或刷子）插入阴道，直至遇到阻力（约6cm），旋转4～6圈慢慢退出后放在盛有保存液的试管中，送实验室进行检验。这种方法在宫颈癌高危人群中进行大规模的初筛更具价值，开辟了宫颈癌筛查方法的新领域。
(3)根据感染的HPV类型预测受检者的发病风险度，决定其筛查间隔,对于细胞学和HPV均阴性者，发病风险较低，可适当延长其筛查间隔，细胞学阴性而高危型HPV阳性者，发病风险度较高，对此类人群要定期随访。
(4)宫颈上皮内高度病变和癌症治疗后的监测。当然用HPV DNA检测筛查宫颈癌时还要注意HPV的流行是因人群而异，年轻妇女的感染通常为一过性，有研究表明HPV DNA检测的效果在较高年龄的女性最佳。研究表明，在年轻女性群体中存在很高比例的一过性HPV感染，因此对30岁以下女性进行HPV DNA检测的临床意义十分有限。而基于mRNA的HPV检测可以反映出病毒致癌基因的持续表达情况，因此可为临床医生提供比DNA检测更具有预测价值的检测结果。
4.2 PCR技术HPV-mRNA检测在宫颈癌筛查和治疗中的临床价值 HPV DNA的检测仅能够发现病毒的存在与否，却不能揭示其病毒的致癌活性。近年来，更多新技术引入全新的概念，将检测对象集中于更具特异性的危险因素，例如致癌基因E6和E7的表达。E6、E7是HPV 的两个早期开放阅读框，其编码的E6、E7蛋白在宫颈癌细胞系和癌组织细胞内持续表达，是维持肿瘤细胞处于转化状态所必须的。实时荧光定量PCR和RT—PCR方法用于检测HPV E6、E7基因结果可靠，特异性强，为进一步研究宫颈标本HPV E6和E7基因的DNA和RNA含量，探讨两个基因的含量与宫颈癌变的关系打下了基础，也有助于优化HPV有关的癌症，包括宫颈癌的筛查［14］。
通过检测E6/E7 mRNA可了解人体细胞内HPV致癌基因产物的持续表达情况。实时扩增检测方法所取得的临床预测效果明显优于HPV DNA检测方法。通过E6/E7mRNA检测可以很好地排除大量具有良性组织细胞学表征的病人。研究表明，基于mRNA的HPV检测与基于DNA的HPV检测具有相近的阴性预测值(Negative Predictive Value， NPV)，而mRNA检测的阳性预测值(Positive Predictive Value， PPV)比后者平均提高了2倍［15］,从而可避免很多不必要的阴道镜检查。
在治疗HPV感染和宫颈癌时（特别是在使用一种新的治疗方法或手段时），可以通过RT-PCR及western blot检测治疗前后细胞中E6、E7 mRNA和蛋白的表达的情况，来更好的了解治疗的效果，从而判断新方法，新手段的有效性。例如：司马妮，王 薇［16］等以HPV18型全基因质粒为模板，PCR法扩增HPV18型E6E7区716bp片段，利用基因重组技术将目的片段反向插入荧光真核表达载体pEGFP-C1，EcoR I酶切并测序鉴定；采用脂转法将重组质粒pEGFPHPV18E6E7as(EGFP-18AS)转染宫颈癌HeLa细胞株，通过RT-PCR及western blot检测细胞中E6、E7 mRNA和蛋白的表达，从而发现反义荧光真核表达载体可以有效的抑制HPV18 Fm、E7癌基因的表达，为治疗HPV感染和宫颈癌提供了一种新的方法。
5 结论
聚合酶链反应技术(PCR技术)是1985年由美国人Mullis和Saiki创建的，这是一种在体外由引物介导的DNA序列酶促合成反应，又称之为基因扩增技术。6l5p G O/～ D3bx Z*F0HPQM"B PCR技术具有特异性强、灵敏度高、对待检原始材料质量要求低等特点。PCR技术在诊断HPV感染和致癌研究中有其广阔的应用前景。用新鲜症状部位、固定包埋的病理组织、分泌物或粘液等标本，采用PCR技术对HPV DNA的检测不仅用于临床HPV所致不同疾病、调查不同人群或个体HPV的感染率，可应用于大范围内的流行病调查；而且更多地应用于HPV致病、致癌机理的研究中。另外，更进一步对HPV-RNA特别是mRNA表达水平的检测，则可用于HPV感染和宫颈癌的疫苗、治疗手段的评估和研发。
以往，PCR应用于实际检测中的限制在于方法的繁琐与较高的假阳性，如何克服这两个问题是促成PCR临床实际应用的关键。从理论上讲，PCR方法可以变得更为简洁和定固化，亦即程序化，其结果应是100%的特异和可靠。总之，PCR检测HPV不管从特异性方面还是从灵敏性方面讲具有其经方法难以匹敌的优势，结果的可靠性及可信性应该是最好的，加之本身方法的极大进步，对于扩充其应用领域极其重要。
【参考文献】
［1］郎景和.迎接子宫颈癌预防的全球挑战与机遇［J］.中华妇产科杂志，2002，37(2):129～131.
［2］Mandelblatt JS,Lawrence WF,Womack SM,et al.Benefits and costs of using HPV testing to screen for cervical cancer［J］.JAMA,2002,287(18):2372～2381.
［3］Heley S.Human papillomavirus:betare the infection you cant see［J］.Aust Fam Physician,2003,32(5):311～315.
［4］Duttagupta C,Sengupta S,Roy M,et al.Oncogenic human papillomavirus infection and uterine cervical cancer:a screening strategy in the perspective of rural India［J］.Eur J Cancer Prew,2002,11:447～456.
［5］Hesselink AT，VandenBrule AJ，Brink AA，et al．Comparison of hybrid capture 2 with in situ hybridization for the detection of high risk human papillomavirus in liquid based cervical samples［J］.Cancer，2004，102(1)：11～18.
［6］Xu Q，Wang YH, Tong WJ，et al.Interaction and relationship between angiotensin converting enzyme gene and environmental factors predisposing to essential hypertension in Mongolian population of China［J］.Biomed Environ Sci，2004，17(2)：177～186.
［7］Hart KW, W illiams OM, Thelwell N，et al. Novel method for detection，typing，and quantification of human papillomaviruses in clinical samples［J］. J Clin Microbio1，2001,39(9)：3204～3212.
［8］Speich N，Sehmitt C, Bollmann R, et al. Human papillomavirus(HPV)study of 2916 cytological samples by PCR and DNA sequencing；genotype spectrum of patients from the westerman area［J］.J Med Microbio1,2004，53(Pt 2)：125～l28.
［9］Stanczuk C A，Kay P,Allan B，et al．Detection of human papillomavirus in urine and cervical swabs from patients with invasive cervical cancer［J］. J Med Virol，2003，71(1)：110～l14.
［10］ Ambretti S，Mirasoli M，Venturoli S，et al．High throughput polymerase chain reaction chemiluminescent enzyme immunoassay for typing and quantifying human papillomavirus DNAs［J］. Anal Biochem，2004，332(2)：349～357.
［11］Schellekens MC，Dijkman A，Aziz MF, et al．Prevalence of single and multiple HPV types in cervical carcinomas in Jakarta．Indonesia［J］. Gynecol Oncol，2004,93(1)：49～53.
［12］Mahboobeh Safaeian, Rolando Herrero,Allan Hildesheim, et al. Concepcion Bratti, Ana Cecilia Rodriguez, Philip Castle, for the Costa Rican Vaccine Trial Group. 2007. Comparison of the SPF10-LiPA System to the Hybrid Capture 2 Assay for Detection of Carcinogenic Human Papillomavirus Genotypes among 5,683 Young Women in Guanacaste, Costa Rica［J］. J. Clin. Microbiol. 45：1447～1454.
［13］An HJ, Cho NH, Lee SY, et al. Correlation of cervica1 carcinoma and precancerous lesions with human papillomavirus(HPV)genotypes detected with the HPV DNA chip microarray method［J］. Caneer，2003,97(7)：1672～1680.
［14］Michael E Scheurer, Laura M Dillon, Zhuo Chen, et al. Adler-Storthz，Absolute quantitative real-time polymerase chain reaction for the measurement of human papillomavirus E7 mRNA in cervical cytobrush specimens，Infectious Agents and Cancer,2007, 2:8 doi:10.1186/1750-9378-2-8.
［15］Molden. Comparaison of HPV mRNA and DNA detection : a cross-sectional study of 4136 women >30 years of age with a 2-years follow-up of high grade sqamous intraepithelial lesion, Int［J］. J. Cancer, 2005,114:973～976.
［16］司马妮，王薇，田训，等. HPV18 E6/E7反义荧光真核表达载体的构建及其在宫颈癌H eLa细胞中的表达［J］. 肿瘤防治研究，2007，34（6）：0402～0403.