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【关键词】 沙门菌；检测
沙门菌（Salmonella）是一群广泛分布于自然界，对人和动物具有极大危害的革兰阴性的肠道病原菌。该菌菌型复杂，目前全球已分离出2 000多个血清型，我国也已发现216个血清型。蛋、家禽和肉类产品是沙门菌病的重要传染源，迄今为止，沙门菌病仍然是全球性（尤其是发展中国家）严重的公共卫生问题。长期以来，人们在与沙门菌病的抗争中探索了不少沙门菌检测方法，沙门菌的分子学和基因水平的研究都得以迅速发展。现将相关进展综述如下。
1 分离培养方法［1］
传统的沙门菌分离培养方法一般分为4个不同步骤：第一步是预增菌，将样品加到一种高营养、无选择性培养基中，置37℃培养，使那些“受伤”的细菌复苏及使所有细菌生长。虽然缓冲蛋白胨水常被建议使用（由于其可保持溶液pH值稳定），但对培养基的选择仍存有争论。第二步是选择性增菌，它使沙门菌生长而使培养基中其他细菌生长受到抑制，目的是提高分离率。与预增菌培养基相似，对选择性培养基的选择，也存在不同观点。目前应用的主要有以下3种培养基：四硫酸钠煌绿（TTB）增菌液、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液和氯化镁孔雀绿（MM）增菌液。由于没有任何一种培养基可以全面保持所有食品等样品中各种沙门菌血清型，所以比较适当的方法是使用两种培养基平行进行试验，但又因此而使工作量倍增，故很有必要研制一种新的合适的增菌培养基。第三步是分离培养，将选择性增菌培养物在含一种或多种抑制非沙门菌生长制剂的琼脂平板上划线培养。第四步是对平板上肉眼可见的特征性菌落进行确认，并进行一系列生化和血清学检测，作出最后鉴定。传统的沙门菌检测方法全程需时4～7d才能得出明确的诊断结果。食品中沙门菌污染量少，常受某些应激损伤，不易恢复，而现行的检测方法得到阴性报告最少需4d，阳性报告还要延迟2～3d。
2 快速检测方法
2.1 酶联免疫法（ELISA）
1998年，黎兆滚用微量板ELISA法在国内一些边境口岸系统对进口动物产品（鱼粉、肉骨粉等）进行沙门菌检测。该法采用预先包被了沙门菌（A～F群）单克隆抗体的微量塑料板，加入增菌液处理的样品，反应后再加入一定的指示剂，作用完毕后用酶标仪测定OD值来判定结果，ELISA法检出沙门菌的极限范围在105～106cfu/ml。因此，要得出可靠的结果，食品等样品首先必须进行预增菌、选择性增菌，以便提高检出阳性率。黎兆滚的微量板ELISA法虽然无需特殊的设备，检验方法也较简单，但是整个试验还需24h以上才能得出结果。
2.2 基因芯片法
该法又称DNA芯片、DNA微阵列，是生物芯片技术中发展最成熟以及率先实现商品化的检测技术。它主要是利用核酸探针互补杂交技术原理研制的。它的工作原理是利用一段人工合成的碱基序列，在其上面连接一些利用现有手段可以检测的物质（如荧光物质等）依据碱基互补的原理，利用基因探针到基因混合物中识别特定基因片段。通过这种方法来检测异常基因或其产物。唐晓敏等将基因芯片用于水中致病菌的快速检测［2］，通过对分离的20株细菌进行了基因芯片的杂交检测，并用传统方法对这些菌株进行鉴定，基因芯片的检测结果与传统方法鉴定结果一致性为95%。目前，已有用于食品致病菌检测的基因芯片产品出售。由于基因芯片价格较高，目前只有少数实验室能应用该法。但是，随着时间的推移，基因芯片价格将会下降，可以肯定该产品有良好的应用和发展前景。
2.3 聚合酶链法（PCR）
PCR技术由于其具备快速、经济、简单等特点，是近年应用较为广泛的分子生物学检测技术，尤其适用于培养困难或传统的血清学方法不易检测的病原微生物以及在突发公共卫生事件中时间要求紧迫的微生物检测工作。根据其检测的指示系统不同，一般分为荧光-PCR、酶联免疫-PCR以及传统的电泳分析等，PCR不但可以定性检测也可以定量检测。对沙门菌的检测一般通过检测多种特异性基因进行。如编码抗原的基因：编码A群和D群O抗原的rfbS基因；编码B群和C2群O抗原的rfbJ基因；编码伤寒O抗原的rfbE基因；编码Vi抗原的ViaB基因以及毒力基因invA、invE、spvC和其他基因Taq Gold，rTth等［3，4］。Baumler认为，编码细胞膜外膜含铁细胞受体的基因iroB对沙门菌诊断有特异性［5］；还有学者认为gyrA基因和rcsC基因之间的插入序列IS 200为伤寒沙门菌所特有，对伤寒有诊断意义［6］。目前，根据上述基因设计引物用于人体或自然界中沙门菌检测，其中Taq Man探针技术的荧光PCR检测沙门菌方法已被广泛应用，并形成了试剂盒作为商品销售，而且该试剂盒已经得到美国食品与药品监管署（FDA）的推荐［7］。谢晓东等报道用蝎形引物PCR快速检测水中沙门菌方法［8］，可最低检出2cfu/ml沙门菌。
2.4 Transia沙门菌卡片检测法
该法以夹心型免疫色谱反应为基础，反应固相包括一块用“抗沙门菌抗体—染料”偶合物浸透的染料衬垫和一张薄膜条，将抗沙门菌抗体固定在薄膜的反应区上，将增菌液滴加到样品小孔内并令其吸收，如样品中有沙门菌抗原存在，它们会与偶合物作用，然后移到膜上，与固定在膜上反应区的抗体结合，5～7min可读取结果。此法要求的实验条件较为简单，可以在普通实验室内使用。
3 沙门菌同源性分析
3.1 扩增片段长度多态性分型（AFLP）
AFLP是目前广泛应用的DNA指纹技术之一，是继限制性片段长度多态性（RFLP）、SSR（Single sequence repeat）、随机扩增DNA多态性（RAPD）之后近几年发展最快的DNA分子免疫学技术，应用范围越来越广［9～13］。AFLP主要是通过PCR扩增基因组DNA限制性片段并进行电泳分析，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列作为引物结合位点。由于AFLP可以使某一个体出现特定的DNA谱带，而在另一个体中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可作为一种分子标记，用于各种大小不同的基因组的指纹分析，为研究原核生物属以下乃至株间的亲缘关系提供了有效手段［14］。AFLP可通过内切酶组合的选择和特异性PCR引物的设计来调整AFLP图谱中限制性片段的适宜数目。虽然，目前已有报道有三种限制性内切酶组合能提出AFLP的分辨率［15］，但最常用的限制性内切酶组合为EcoRI/MseI型，并已实现商品化。由于细菌的基因组比真核细胞小得多，在特异性引物上一般只用1个选择性核苷酸［16］。AFLP结合了限制性片段长度多态性（RFLP）和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性，因此，有人认为AFLP对沙门菌的鉴定能力优于基因探针技术和PFGE［17］。AFLP目前已有多种商品化试剂盒，并实现了自动化检测。作为一种新型的分子生物学检测方法，AFLP有着很好的应用前景。但该法不但成本较高，而且需要操作者具备较高的检验技术，目前一般实验室尚难应用。
3.2 脉冲场凝胶电泳分型（PFGE）
该法利用2种或更多可变换的电场进行电泳的脉冲场凝胶电泳（PFGE），具有操作简单、重复性好、分辨率高、易标准化的特点，但需要特制的脉冲场凝胶电泳仪，对操作者的技术要求较高，限制了它的应用。该法常用于大分子量的DNA的检测［18，19］，用PFGE分离的DNA片段约为12Mb。Toshiyuki等［20］用PFGE对来自临床分离的沙门菌菌株进行检测，用BinI和XbaI进行酶切，分析PFGE后得到的DNA图谱发现，同一噬菌体型的分离株的PFGE图谱各不相同，说明在研究沙门菌的爆发和流行的同源性PFGE优于以往常用的噬菌体分型的分子流行病学研究手段。因此，用PFGE技术建立标准化的图谱，对分析沙门菌流行株的同源性有重要意义。
3.3 核糖体分型
核糖体RNA（rRNA）目前在技术上主要是采用分子杂交和探针技术，探针标记物一般多为地高辛。我国学者曾用16srRNA作探针，对来自贵州省不同地区、不同时间的209株伤寒菌进行核糖体分型（RT型）［21］。结果显示，这些菌株分属于26个RT型，以RT1和RT2型为优势，提示贵州地区伤寒存在众多的克隆群，这可能是贵州省伤寒多年来发病率一直居高的原因。核糖体分型技术虽然特异性较强，敏感性也较高，不需要特定的仪器，但操作较繁杂，需要较熟练的技术。
3.4 目前，应用于沙门菌同源性分析的检验方法主要是AFLP、PFGE和核糖体分型。但是，这些方法大多都需要特殊的仪器设备和具有操作水平熟练的专业技术人员，实验成本也较高。目前，只在实验设备好、人员素质高的中心实验室使用。
4 结语
近年来，沙门菌检验技术受到人们的高度重视，尤其是分子生物学技术在该领域的应用受到普遍关注。应用这些技术已逐渐阐明了沙门菌的许多遗传学和分类学等方面的问题，并通过检测种属特异性基因来检测标本中病原体的存在与否，使沙门菌病自动化检验和快速诊断成为可能；同时，由于分子生物学技术的同源性分析也使分子流行病学得到迅猛发展。但是，应该指出，虽然目前检验技术的快速发展，各种新技术、新方法层出不穷，可是各种方法的结果其意义是不同的。传统的病原分离培养技术虽然费时耗力，检出敏感性也较差，但迄今不论在疾病的诊断还是在卫生学评价中仍是不可缺少的金标准，是分子生物学技术等检验方法不能代替的。分子生物学技术不能显示微生物的生存性或微生物是否存在感染的过程，反之，微生物的分离培养可以证实微生物的生存性，同时病原微生物的分离培养是深入进行微生物、流行病学和临床学研究的基础，也是分子生物学等新技术在检测检验方面应用的基础。
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作者单位：广西壮族自治区疾病预防控制中心,广西 南宁 530028.