点击显示 收起
【摘要】 目的 建立高效液相色谱法检测保健品中西地那非的方法。方法 采用固相萃取法对样品提取液进行净化处理，在C18(15cm×2.1mmi.d,5μm)色谱柱上，流动相为含60%甲醇的三乙胺水溶液，流速0.3ml/min,柱温35℃，检测波长290nm。结果 方法相对标准偏差在0.50%～6.3%之间，回收率在94.54%～99.16%之间。线性相关系数r为 0.9998。结论 建立的方法具有较好的精密度和准确度，前处理操作简便，可应用于保健品中西地那非的测定。
【关键词】 高效液相色谱;固相萃取;西地那非;保健品
Methodology of determination of Sildenafil in health products by HPLC.
HE Cai, ZHONG Yue-tong, JIANG Jie, et al.
Shenzhen Municipal Center for Disease Control and Prevention, Shenzhen 518020, Guangdong, P. R. China
Abstract：Objective To establish a method to determine Sildenafil in health food by high performance liquid chromatography. Methods Solid-phase extation was used to purify the samples. C18(15cm×2.1mmi.d, 5μm)was used at 35℃ and Mobile phase containing 60% methanol solution of triethylamine, with flow rate of 0.3ml/min, and the detection wavelengh was 290nm. Results The relative standard deviations were 0.50%～6.30% and the recoveries were 94.54%～99.16% .The correlation coefficients for the linear equation was 0.9998. Conclusion This method is precise and accurate,and the procee of pre-treatment was simple, suitablel to be used for determination of sildenafil in health food.
Key words：High performance liquid chromatography; Solid-Phase Extation; Sildenafil; Health food
枸橼酸西地那非(Sildenafil citrate)，简称西地那非，是万艾可(又称伟哥，英文名Viagra)的主要活性药物成分［1］。化学名称为：1-{4-乙氧基-3-［5-(6,7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑并［4,3d］嘧啶)］苯磺酰}-4-甲基哌嗪枸橼酸盐。分子式：C22H30N6O4S·C6H8O7，分子量666.70，结构式见图1。
西地那非由美国辉瑞公司于1994年原创，1998年5月获美国FDA批准，同年6月在美国上市，适用于治疗男性勃起功能障碍（ED）［1,2］。随着国家对中成药中西地那非检查力度的增加，一些厂家把眼光转向了保健食品，开始在一些保健食品违法添加西地那非，并吹嘘其效果，因此，有必要开展对保健食品中西地那非中的检测工作［3,4］。
目前对保健品中西地那非中的检测仍没有公认的国家标准方法，一些单位采用了检测中成药的方法［3］，但由于食品和中成药的组成与本底不同，简单的移植检测方法会有干扰大本底高等副作用，且无法进行有效的确证工作，难以得出权威可信的结果。
固相萃取是一种比较重要的样品处理技术［5］。使用固相萃取法可以更容易的获得高回收率的被测物，去除被测物中的杂质干扰。本文利用固相萃取技术进行样品前处理，高效液相色谱法测定，并进行了多种条件的优化处理，结果证明，该方法结果准确可靠，抗干扰能力强。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器
高效液相色谱仪(Agilent1100型),电子天平( AE-200型, DJ-600T型),小型电子振荡器(KS130型),PH计( PH510型),超声清洗器(HBD-1002型),C18柱(色谱科公司发现号，规格为15cm长，内径2.1mm,粒径5μm)针筒式微孔滤膜过滤器(直径13mm,孔径为0.45mm，有机系型),固相萃取小柱(填料为C18，容量为3ml，重量为500mg，色谱科公司)移液枪(吸液量为100～1 000μl)。
1.1.2 试剂
甲醇，三乙胺均为色谱纯(Merck公司),超纯水(由Millipore纯水机制得),西地那非标准品(纯度为99.5 %，广东省药检所提供),检测样品：实际检测样品均来源于科研课题 “深圳市保健品中西地那非状况调查和方法研究”的研究样品。
1.1.3 流动相的配制
取三乙胺1.0ml，溶于400ml超纯水中。用浓度为1%的磷酸溶液调pH至6.0，用超纯水稀释至500ml。取400ml配好的三乙胺水溶液和600ml纯甲醇混合，用1%的磷酸溶液调pH至 6.86放入超声清洗器中除气30min。剩下的100ml三乙胺水，作样品前处理用。
1.1.4 西地那非标准溶液
精确称取西地那非0.025g枸橼酸西地那非，用甲醇定容至25ml容量瓶，得浓度为1.00g/L的标准储备液。使用前稀释为标准使用溶液，使用前与三乙胺水1：1混合后进样测定。
1.2 方法
1.2.1 色谱条件
色谱柱：色谱科发现号C18柱(15cm×2.1mmi.d,5μm)，流速:0.3ml/min，柱温：35℃,检测波长：290nm。
1.2.2 样品前处理
将样品粉碎均匀后，准确称量0.20g，加入10.0ml甲醇提取，振荡30min 。过滤后取1.0ml用甲醇稀释100倍。
西地那非在C18萃取管上不保留，干扰物却牢固的保留在萃取管上，提取液的净化正是利用了这种特性。西地那非的样品前处理的净化过程分两步，首先，用2.0ml甲醇活化C18小柱，洗净柱中杂质，并抽干；然后，将过滤后的样液1.0ml倒入萃取柱，用3ml甲醇分三次洗脱，抽干至无液滴。将分三次洗脱收集到的样液混合在一起，用甲醇定容至2.5ml，取1.0ml与三乙胺水1：1稀释。用微孔滤膜过滤后进样测定。
2 结果
2.1 检测波长的确定
对1.0mg/L的西地那非标准溶液进波长扫描，结果表明在290nm有最大吸收（见图2），且不受流动相中其他物质的干扰，故以下实验均采用290nm波长进行测定。由图3可见，采用290nm波长进行测定西地那非的谱图清晰，峰型较好。
2.2 流动相中甲醇比例的确定
配制不同甲醇比例的流动相，用同一色谱条件下测定100mg/L西地那非标准溶液，结果表明，用流动相甲醇比例在76%～52%时，保留时间从2.029min逐渐增加到9.261min. 甲醇比例在76%时的保留时间为2.029min,时间比较短,与杂质的分离较差；在61.6%时的保留时间为4.857min,比较合适;56.8%以下的保留时间较长,不适合大量样品的测定，所以方法选用61.6%的甲醇水作为流动相。
2.3 标准曲线实验
取1.00g/L的西的那非的标准储备液2.5ml用60%甲醇+40%三乙胺水溶液至25ml容量瓶中,得到浓度为100mg/L的储备液，取100mg/L的西的那非的标准储备液2.5ml用60%甲醇+40%三乙胺水溶液至25ml容量瓶得到浓度为10mg/L的储备液，取10mg/L的西的那非的标准储备液5ml用60%甲醇+40%三乙胺水溶液至10ml容量瓶得到浓度为5mg/L的储备液。
分别取100mg/L的西的那非的标准储备液2ml,2.5ml,5ml用60%甲醇+40%三乙胺水溶液至10ml容量瓶得到浓度为20mg/L,25mg/L,50mg/L的储备液。
标准系列浓度为5mg/L,10mg/L,20mg/L,25mg/L,50mg/L,绘制曲线,进样20μl,相应结果详见表1，以峰面积对5～50mg/L浓度求得线性回归方程y=33.5985+69.2409x,相关系数r=0.9998。表1 标准系列浓度5～50mg/L的检测结果标准的浓度（略）
2.4 检出限
按3倍信噪比（S*N）得出最小检出限量，最后检出限为0.5mg/L。
2.5 精密度实验
取浓度分别为5mg/L,10mg/L,20mg/L,25mg/L,50mg/L的西地那非标准溶液，各进样5次，进样量20μl,实验结果，以峰高计算相对标准偏差在0.20%～2.54%之间，以峰面积计算的相对标准偏差在0.50%～6.30% 。所以，本方法的数据处理应以峰面积来计算。
2.6 回收率实验
放上spe小柱，用2ml甲醇润洗，抽干。保持20～30滴/min抽干至无液滴，上样1ml（20mg/L标准溶液，溶剂：甲醇）。用甲醇洗脱，抽干至无液滴。用甲醇将收集液定容至2.5ml,混匀。取1ml与三乙胺水1：1稀释，过滤，上机测定。重复加标准7次。取1ml的加标样品提取液用甲醇定容至2.5ml，混匀。取1ml三乙胺水1：1稀释，过滤，上机测定作为对照，计算回收率，结果表明不同浓度的回收率在94.54%～99.16%之间。
2.7 实际样品检测
根据本研究的分析方法对市场13个实际样品进行西地那非含量的测定，其中有3个含有西地那非，测定结果详见表2。表2 实际样品测定结果样品编号样品名检测结果（略）
3 讨论
3.1 如果单纯用甲醇水作流动相，无法得到良好西地那非峰形（见图6），而在流动相中加入三乙胺后，抑制了溶质的离子化，减少谱带拖尾，峰形得到了明显的改善（见图7）。而且如果样品处理液没有添加三乙胺时，目标峰形也不理想，因此在配制流动相和最终得到样品处理液时，均要使用三乙胺水溶液。
3.2 流动相的pH值变化将影响西地那非的色谱分离。本方法选择流动相最终的 pH值为6.86 ，在样品上机测定前应用流动相冲柱至少1h，待曲线平稳后再测定，这样得到的峰型较好，比较尖锐。
3.3 做完样品后，在更换流动相时，要注意将原有体系中的三乙胺冲洗干净，先用低比例甲醇水溶液（甲醇含量为10%左右）充分冲洗柱子中的残留三乙胺，再逐渐过渡到高比例的甲醇水溶液，最膈用纯甲醇状态保存柱子。
3.4 在定性方面，除了通过保留时间定性外，还要充分利用DAD检测器的光谱图进行确证。如果保留时间和标准对照一致，且光谱图表现一致,则可确定样品中含有枸橼酸西地那非［21］。
3.5 在进行固相萃取处理时，要考虑到不同品牌的小柱存在差异，试验使用了Agillet公司的C18固相萃取小柱，发现它对西地那非的吸附非常强，无法进行有效洗脱，后选择使用Water公司固相萃取小柱。洗脱效果良好。
3.6 在对胶囊类保健品进行样品前处理时，通常的做法是按照可食部分取样，只取胶囊内的药粉，而外壳则弃去。这种实验室常见的做法却会被不法厂家钻空子，在我们对胶囊的外壳与内容物进行了分别处理检测后发现，一些保健品就是在胶囊的外壳中加入西地那非，而内部装的仅仅是淀粉一类的填充物，这样很容易在检测时蒙混过关。所以我们样品前处理时一定要将完整的样品整体取样。
3．7 由于为了达到药效，需要在单次服用时达到一定的剂量，所以保健品中如果掺有加入西地那非，含量不会太低（有时达到10%左右），考虑到仪器灵敏度和防止柱污染，可以减少取样量并将样品处理液进行大比例的稀释，具体稀释倍数由具体样品决定。
本方法应用反相液相色谱法和固相萃取技术，对样品的前处理、净化以及优化色谱条件多个方面进行了探讨，确定了相应的测定条件 。最后确定使用甲醇为提取溶剂，以固相萃取法进行净化，以60%甲醇三乙胺水溶液为流动相，流速0.3ml/min，柱温35℃，检测波长290nm，可以较好的测定保健品中的西地那非。本方法线操作简单，重现性好，精密度和准确度都较高，可以在各级保健品检测机构内得到较好的应用,并在科研课题 “深圳市保健品中西地那非状况调查和方法研究”中发挥了积极的作用。
【参考文献】
［1］FDA. Center for drug evaluation and research［R］. Application Number 020895, 1998,3:27.
［2］林敏. 西地那非的药理作用和在心血管病人中的应用［J］.心血管康复医学杂志,2001,10（2）：187～188.
［3］雷灼雨,罗萍,周渝南. 补肾壮阳药中非法加入西药“枸橼酸西地那非”的检出方法［J］. 中国药品标准,2005,6（5）：61～62.
［4］王洪允，江翼，胡蓓,等.固相萃取技术进展及在生物药物分析中的应用［J］.药物分析杂志,2003,23（3）:236～239.
［5］朱斯幸. 补肾壮阳类保健品中添加枸橼酸西地那非的调查与分析［J］. 西北药学杂志 , 2003, 18(4)：180～181.
作者单位：深圳市疾病预防控制中心，广东 深圳 518020.