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【摘要】 目的 研究慢性肝炎外周血淋巴细胞亚群的变化。 方法 健康医护人员10例，乙肝病毒携带11例，慢性乙型肝炎21例通过流式细胞术进行外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+检测。 结果 CD3+CD4+/CD3+CD8+比值、CD3+CD8+百分率在三组间有显著性差异（P<0.01,P<0.05）。CD3+CD4+百分率，CD3+百分率在慢性乙型肝炎组，乙肝病毒携带组与对照组无统计学意义。结论 慢性乙型肝炎患者体内存在细胞免疫功能障碍，外周血CD3+CD8+百分率升高，CD3+CD4+/CD3+CD8+比值降低，无CD3+CD4+百分率变化，可能与其功能变化有关。
【关键词】 慢性乙型肝炎;T淋巴细胞亚群
Variations of peripheral blood CD3+CD4+, CD3+CD8+ and CD3+ T lymphocyte in chronic hepatitis B patients.
WU Xiao-feng, QIN Hao-ge, XIN Xiao-li, et al.
First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang Liaoning 110004, P. R. China
Abstract：Objective To investigate the the vatiations of peripheral blood T lymphocyte subsets in chronic hepatitis B patients. Methods All subjects were divided into control group consisted of 10 heathy subjects,hepatitis B virus carrier group consisted of 11 cases and chronic hepatitis B group consisted of 21 cases. The levels of peripheral blood CD3+CD4+, CD3+CD8+ and CD3+ T lymphocyte were determined by flow cytometry. Results The ratios of CD3+CD4+ T lymphocyte/CD3+CD8+ T lymphocyte and the percentages of CD3+CD8+ T lymphocyte among 3 groups were statistically differences among the three groups (P<0.01,P<0.05).The percentages of CD3+CD4+ and CD3+ in chronic hepatitis B group and hepatitis B virus carrrier group did not show significant differences as conpared with that of control group. Conclusion There is cellular immune disorder in patients with chronic hepatitis B. The percentages of CD3+CD8+ T lymphocyte is increased and the ratio of CD3+CD4+ T lymphocyte to CD3+CD8+ T lymphocyte decreased． There were no differences in percentages of CD3+CD4+ T lymphocyte.
Key words：Chronic hepatitis B patients; T lymphocyte subsets
乙型肝炎是一种免疫相关性疾病，机体感染HBV后并不直接对肝细胞造成损伤，而是通过诱发机体的免疫反应间接损伤肝细胞［1,2］。乙型肝炎的免疫病理主要由T细胞免疫应答状态决定。外周血HBV特异性免疫应答如何启动肝内非特异性免疫应答细胞及细胞因子具体环节还不太清楚。对于乙型肝炎的病毒复制状态差异，主要仍取决于乙型肝炎特异性T细胞免疫功能状态。肝内NK(自然杀伤细胞)及NKT(自然杀伤T细胞)等免疫应答细胞功能主要为免疫放大作用［3］。本实验主要通过流式细胞术检测外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+、CD3+CD4+/CD3+CD8+在不同组间的变化。
1 材料和方法
1.1 研究对象
对照组10例，沈阳市传染病院健康医护人员，年龄26～35岁，平均(29.60±2.88)岁；乙肝病毒携带11例，年龄13～47岁，平均(32.62±8.04)岁,沈阳市传染病院门诊患者；慢乙肝21例，沈阳市传染病院住院患者，年龄11～58岁，平均(33.21±12.11)岁。所有患者按2000年西安会议所修订的病毒性肝炎诊断标准入选。均排除甲、丙、丁、戊型肝炎的重叠感染，排除EB病毒、CMV病毒感染，排除自身免疫性肝病、酒精性肝病及脂肪肝，排除近6个月应用糖皮质激素、IL-2及胸腺肽、干扰素及拉米夫定治疗。
1.2 主要试剂和仪器
TRITESTCD4FITC/CD8PE/CD3PerCP（美国BD公司）,Optilyse C lysing solution（美国BD公司）;流式细胞仪BECTON DICKINSON FACSort（美国BD公司）
1.3 方法
1.3.1 标本处理
清晨采空腹静脉血2ml，EDTAK3抗凝。在样品测定管中加入20μl TRITESTCD4FITC/CD8PE/CD3PerCP，然后加入100μl抗凝血，振荡混匀，室温避光30min。加入2ml溶血素，振荡混匀，室温避光放置10min以上。1 500r/min,离心5min，弃上清液。加入2ml PBS，1 500r/min,离心5min，弃上清液，重复一次。加入900μl PBS，上流式细胞仪分析。
1.3.2 流式细胞仪数据获取和分析
全部数据用流式细胞仪和软件CELL QUEST进行荧光参数获取和分析。在前散射和侧散射的二维Dot-plot图中，划出淋巴细胞区，然后对淋巴细胞作FITC和PE的荧光强度检测，荧光Ⅰ（FL1）为FITC，滤过片为（530±10）nm带通，荧光Ⅱ（FL2）为FE，滤光片为（575±10）nm带通。数据分析时，在确定每次检测阳性细胞百分率之前，根据lsotype的非特异性荧光强度设定界限，以确定双阴性、双阳性和单阳性区。
1.4 统计处理
SPSS11.5统计软件分析，T淋巴细胞百分率用均值±标准差表示，组间均数比较用t检验，方差分析用F检验。
2 结果
2.1 慢性乙型肝炎组CD3+CD4+/CD3+CD8+百分率比、CD3+CD8+百分率与对照组
CD3+CD4+/CD3+CD8+百分率比、CD3+CD8+百分率有显著性差异（P<0.01,P<0.05）;而乙肝病毒携带组CD3+CD4+/CD3+CD8+百分率比、CD3+CD8+百分率与对照组CD3+CD4+/CD3+CD8+百分率比、CD3+CD8+百分率无显著差异。结果见表1。
2.2 CD3+CD4+/CD3+CD8+百分率比降低
CD3+CD8+百分率升高在三组间有显著性差异（P<0.01,P<0.05），对照组CD3+CD4+/CD3+CD8+百分率比最高，慢性乙型肝炎组CD3+CD8+百分率最高。见表1。表1 各组CD4+、CD8+、CD3+、CD4+/CD8+的结果（略０
2.3 各组间CD3+CD4+百分率，CD3+百分率无显著性差异（P>0.05）。见表1。
3 讨论
HBV感染后，机体主要依靠细胞毒效应和非细胞毒效应两种免疫机制清除，其中T淋巴细胞参与的细胞毒效应起主要作用［5,6］。慢性乙型肝炎患者体内的免疫状态与病情密切相关。
T细胞免疫应答在组织相容性抗原的限制下，经特异性的抗原识别，并在应答过程中主要由细胞因子完成［7］。机体的特异性细胞免疫包括CD8+细胞毒性T细胞（CTL）和CD4+辅助性T细胞(Th)。CTL有直接被HBV感染肝细胞激活的特性，作为免疫应答损害感染的肝细胞，也清除病毒。CTL介导的细胞毒活性，可以是基于穿孔素的坏死或基于CD95的细胞凋亡，CTL作用的细胞死亡常同时有这两种机制。CTL识别HBV感染肝细胞表面的靶抗原后，执行两种不同的功能：杀伤小部分感染的肝细胞；分泌IFN-γ和TNF-α［8,9］，在肝细胞无损伤过程中清除病毒。HBV特异性CTL对感染HBV肝细胞的识别被认为是引起肝损害和清除病毒的中心机制。Sing［10］等在慢性乙型肝炎患者系统观察HBV特异性T细胞免疫功能变化，多数患者仅在病情复燃时出现轻度阳性，说明慢性乙型肝炎患者有HBV特异性T细胞免疫功能不足。
应用CD系列单克隆抗体能识别人T淋巴细胞表面抗原决定簇。其中CD3+与全部成熟的T细胞起反应，它可代表T淋巴细胞总数，CD4+和CD8+分别与T辅助诱导亚群和抑制杀伤亚群起反应［11］。目前本实验室不能检测HBV特异的CD8+细胞毒性T细胞，仅能检测CD3+CD8+T细胞，所以本实验检测的是外周血CD3+CD8+、CD3+CD4+、CD3+T淋巴细胞。
本实验检测发现，慢性乙型肝炎组CD3+CD4+/CD3+CD8+百分率比降低CD3+CD8+百分率升高,与对照组有显著性差异（P<0.01,P<0.05)。CD3+CD4+/CD3+CD8+百分率比、CD3+CD8+百分率、三组间有显著性差异（P<0.01，P<0.05)。乙肝病毒携带组CD3+CD4+/CD3+CD8+百分率降低，CD3+CD8+百分率升高与对照组无显著性差异（P＞0.05）。CD3+CD4+百分率、CD3+百分率在各组间无变化。
文献报导［12］慢性乙型肝炎外周血CD3+CD8+百分率升高，CD3+CD4+/CD3+CD8+百分率比降低，与本实验结果一致，提示慢性乙型肝炎患者体内存在特异性CD8+T细胞免疫功能障碍。段国荣等［13］报导，CHB患者外周血CD3+CD4+百分率、CD3+CD4+/CD3+CD8+百分率比下降，李梦东等［14,15］报告：CD3+CD4+百分率在各型肝炎均有下降，CD3+CD8+细胞均明显高于正常对照组，CD3+CD4+/CD3+CD8+百分率比明显下降，在慢性乙型肝炎患者中，肝功能损害越重，其变化程度愈明显，而随着病情缓解，这种变化接近正常，其中CD3+CD4+百分率下降，与本实验结果不一致。孙昕报导［16］慢性乙型肝炎外周血CD3+百分率降低、CD3+CD8+百分率升高与对照组有显著性差异，其中CD3+CD8+百分率升高，与本实验结果一致，本实验无CD3+百分率降低。实验结果的差异与实验方法、试剂及病例不同有关。本实验结果CD3+百分率在慢性乙型肝炎组、乙肝病毒携带组与正常对照组无显著性差异，提示HBV侵人人体后，受染患者的成熟T细胞量无改变。李玲报导［17］慢性乙型肝炎患者淋巴细胞活化、增殖与凋亡共存，即一部分淋巴细胞在病毒抗原刺激下经活化增殖后凋亡，另一部分淋巴细胞在刺激下活化增殖。所以外周血T淋巴细胞总数可无变化，与本实验结果一致。本实验CD3+CD4+百分率在慢性乙型肝炎组、乙肝病毒携带组与正常对照组无显著性差异，提示慢性乙型肝炎患者无CD4+细胞百分率的变化。
【参考文献】
目的 研究慢性肝炎外周血淋巴细胞亚群的变化。 方法 健康医护人员10例，乙肝病毒携带11例，慢性乙型肝炎21例通过流式细胞术进行外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+检测。 结果 CD3+CD4+/CD3+CD8+比值、CD3+CD8+百分率在三组间有显著性差异（P<0.01,P<0.05）。CD3+CD4+百分率，CD3+百分率在慢性乙型肝炎组，乙肝病毒携带组与对照组无统计学意义。结论 慢性乙型肝炎患者体内存在细胞免疫功能障碍，外周血CD3+CD8+百分率升高，CD3+CD4+/CD3+CD8+比值降低，无CD3+CD4+百分率变化，可能与其功能变化有关。
作者单位：中国医科大学附属第一医院,辽宁 沈阳 110004.