白色念珠菌磷脂酶B的研究进展

【摘要】  目的 介绍近年来对磷脂酶B及其与白色念珠菌毒力关系的研究进展。 方法 查阅国内外大量关于磷脂酶B的研究文献，并进行详述。 结果 白色念珠菌是最常见的条件性致病真菌。磷脂酶B是磷脂酶家族中的重要成员，与90%的念珠菌磷脂酶细胞外活性有关，在白色念珠菌的毒力方面起着重要作用。 结论 磷脂酶B的研究成果将有助于进一步明确白色念珠菌的致病机制、耐药机制，为抗真菌药物的开发及白色念珠菌病的诊断和治疗等方面提供了新的前景。

【关键词】  白色念珠菌 磷脂酶B 毒力

白色念珠菌(Candida albicans,CA)是人体皮肤粘膜的正常寄生菌，也是临床上重要的条件致病性真菌。它可引起皮肤、黏膜及内脏的念珠菌病，是免疫力低下宿主感染的重要致病真菌之一，可导致浅表或深部的白色念珠菌病。因此，白色念珠菌的毒力问题一直广受关注。目前认为，细胞外磷脂酶B是其潜在的毒力因素，在白念珠菌感染的早期发挥作用［1］。现将白色念珠菌磷脂酶B的研究进展综述如下。

　　1  白色念珠菌细胞外磷脂酶
   
　　早在二十世纪六十年代，Costa等就报道了白色念珠菌分泌细胞外磷脂酶。随后在含有血清和羊红细胞的培养基上的研究也发现，很多白色念珠菌的致病性菌株具有磷脂酶活性［2］。在此之后，磷脂酶与念珠菌毒力的相关性就逐渐受到人们的重视。目前已经证实磷脂酶在念珠菌对宿主细胞的穿入、损伤和溶解中发挥着作用。因此，磷脂酶被纳入念珠菌毒力因子的范畴内。同时，越来越多的学者开始对念珠菌细胞外磷脂酶进行研究。
   
　　磷脂酶广泛存在于生物体内。根据磷脂酶作用的特异性脂键的不同，将其归为磷脂酶A、B、C和D四类。尽管所有磷脂酶都可以水解磷脂，但一种酶只能特异性地切断某种脂键。Ibrahim等通过与标准的磷脂酶A2、磷脂酶B、磷脂酶C、磷脂酶D在蛋黄平板培养基上产生的沉淀圈的对照分析，发现白色念珠菌的磷脂酶主要是磷脂酶B［2］。Ghannoum认为在所有磷脂酶家族成员中磷脂酶B与90%的念珠菌磷脂酶细胞外活性有关［2］。

　　2  磷脂酶B的分子生物学研究
   
　　磷脂酶B具有水解酶和溶血磷脂酶-转酰基酶的活性。水解酶的活性可清除磷脂(磷脂酶B的活性)和溶血磷脂中的脂肪酸(溶血磷脂酶的活性)，转酰基酶活性则将游离脂肪酸转移到溶血磷脂而生成磷脂。这些复杂的性质导致了对其命名的混乱［2］。因此，有些学者称为磷脂酶B，有些学者称为溶血磷脂酶-转酰基酶。近来，通过对磷脂酶B编码基因的克隆和敲除，进一步证实了该酶具有水解酶和溶血磷脂酶-转酰基酶的活性。
   
　　研究推测，磷脂酶B包括5个多基因家族成员。但目前仅在白色念珠菌上分离到B1、B2、B5三个亚型，并已得到了白色念珠菌磷脂酶B1、B2的编码基因［3～5］。20世纪90年代初，Mirbod等通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术从磷脂酶活性较高的白色念珠菌中纯化了磷脂酶B。该酶是一种分泌型糖蛋白，分子量84kD，由605个氨基酸残基组成。通过测序发现，其基因包括6700个碱基序列，其中包括一个1818个碱基对构成的开放读框结构。该磷脂酶的水解酶活性为117μmol·min-1·mg-1，转酰基酶活性为459μmol·min-1·mg-1，最适pH为6.0。而后，Leidich等［3］在研究中将该纯化蛋白命名为白色念珠菌磷脂酶B1。应用wra-blaster技术打断目的基因构建了磷脂酶B1缺陷型菌株，该株表达的磷脂酶B1分子量是66.441kD。其分子量低于野生菌株，推测野生型菌株与缺陷型菌株间这种分子量的差异是由于野生型菌株在蛋白质翻译后再次进行糖基化的结果。白色念珠菌磷脂酶B1与酿酒酵母、点青霉、德色鲁克串孢和粟酒裂殖酵母等真菌的磷脂酶具有较高同源性［6］，其同源性分别为 45%、42%、48%和38%。另外，除白色念珠菌磷脂酶B1外，其它菌种的磷脂酶B1的羧基端都有一段信号肽，此信肽最终被糖基化磷脂酰肌醇(Glycosylphatidylinositol，GPI)结合位点所替代。此位点与磷脂酶B1结合后将磷脂酶B1固定在细胞膜上，或与细胞壁上的几丁质结合而固定于细胞壁上。GPI结合位点对磷脂酶B1向细胞外的释放起调节作用。由于白色念珠菌磷脂酶B1的羧基端无这一信号肽，其分泌失去了GPI位点对它的调节，故而持续性地分泌到细胞外。
   
　　1999年，Sugiyama等［5］用相似于克隆caPLB1的方法克隆到caPLB2编码基因而证实并纯化了磷脂酶B2，该酶的分子量为67kD，由608个氨基酸残基组成，与酿酒酵母、德色鲁克串孢和粟酒裂殖酵母的同源性分别是42%、46%、42%。与白色念珠菌磷脂酶B1一样无疏水性的羧基端，白色念珠菌磷脂酶B2的分泌同样失去了GPI结合位点的调节，而持续性地分泌到细胞外［7］。
   
　　最近，Theiss等人［3］又首次分离到了磷脂酶B5，它是目前在白色念珠菌分离到的磷脂酶B家族的第三个成员。但是目前对其功能尚不十分清楚。推测其具有GPI结合位点，通过RT-PCR发现，念珠菌丝状生长及各种环境因素都会影响到该酶基因的表达。通过对基因缺失突变株的研究进一步发现，该酶是磷脂酶A（2）发挥功能所不可缺少的重要因素。
   
　　目前认为这些被分泌的磷脂酶起源于细胞膜或细胞壁。Siafakas［8］等通过扫描新生隐球菌的磷脂酶B发现，磷脂酶B通过GPI结合在细胞壁上。磷脂酶B1上含有β-1,6-葡聚糖，该结构与细胞壁上的β-1,3-葡聚糖形成共价结合。β-1,3-葡聚糖酶可以水解β-1,3-葡聚糖而使磷脂酶B从细胞壁上脱落下来。加热等环境因素可以使磷脂酶B在细胞壁上聚集而使分泌量减少，以及细胞外磷脂酶上检测到的β-1,6-葡聚糖结构都证实了细胞外磷脂酶来源于致病真菌的细胞壁。

　　3  细胞外磷脂酶B与白色念珠菌毒力的关系

　　3.1  对念珠菌侵袭力的影响  白色念珠菌磷脂酶B可以分解宿主细胞膜磷脂而引起膜的通透性增高和完整性受损，从而促进白色念珠菌的侵入。Leidich等［4］用扫描电镜观察磷脂酶B缺陷型和野生型白色念珠菌对上皮细胞和脐静脉内皮细胞的穿透性时发现，它们对上皮细胞和脐静脉内皮细胞的穿透率差异明显。分别取野生型和缺陷型白色念珠菌培养的上清液加于上皮细胞，发现野生型菌株的上清液对上皮细胞的损伤率是缺陷型菌株上清液的两倍。白色念珠菌的磷脂酶B1基因敲除株(CAplb1)的生长和出芽不受影响，仅出现磷脂酶活力的下降。采用二种动物模型测定了CAplb1株的致病性，在血源播散性小鼠模型中，CAplb1株在组织器官中的清除率和小鼠的存活率均有显著提高；在口腔胃肠道幼鼠模型中，CAplb1株仅侵入肠粘膜内层，引起轻微的中性粒细胞浸润性炎症反应，而野生株可侵入粘膜下层，有明显的中性粒细胞浸润性炎症反应，并可导致系统性感染。运用免疫荧光法测定磷脂酶B在白色念珠菌感染小鼠和患者体内的表达，结果显示在感染的血清、组织器官以及在感染的过程中均有磷脂酶B的高滴度表达。以上数据证明了磷脂酶B是白色念珠菌经胃肠道感染和引起血源性感染的重要毒力因子［9］。但CAplb1株并非完全没有毒力，这也证明了白色念珠菌的致病性是多种毒力因子共同参与的结果。

　　3.2  磷脂酶B分泌的特殊性  正如前文所述，多数磷脂酶疏水的梭基往往被糖基化磷脂酰肌醇(GPI)替代［8］，GPI可与细胞膜或细胞壁上的成分结合并调节这种酶的分泌。白色念珠菌磷脂酶B1、B2缺少这一结构，这也就意味着白色念珠菌磷脂酶B1、B2的分泌不像非病原性真菌磷脂酶分泌那样需依赖GPI的调节，因此能直接而持续地分泌。

　　3.3  磷脂酶B与药物敏感性的关系  磷脂酶可以水解两性霉素B脂质体中的磷脂键，而促进其释放。Swenson等［10］研究发现，两性霉素B脂质体对磷脂酶B缺陷型菌株的最小抑菌浓度高于野生型菌株，提示白色念珠菌磷脂酶B有可能促进了两性霉素的释放。但是，通过两性霉素B脂质体治疗磷脂酶B缺陷型菌株感染的小鼠模型依然有效，因而推测两性霉素B脂质体中两性霉素B的释放与白色念珠菌和宿主的磷脂酶B均有关系。Gottfredsson等［11］将白色念珠菌和新生隐球菌的磷脂酶缺陷株与野生株分别进行药敏试验，却并没有发现两者对两性霉素B脂质体敏感性的显著性差异，并据此认为细胞外磷脂酶活性并不影响其对两性霉素B脂质体的敏感性。可见两性霉素B的释放机制复杂，尚需进一步研究。

　　3.4  磷脂酶B与其他毒力因子的关系  凡是能够在宿主体内表达并增强念珠菌致病力的因素，我们均可认为是念珠菌的毒力因子。比较公认的毒力因子包括粘附力、分泌型蛋白酶、磷脂酶等。许多学者认为白色念珠菌磷脂酶B与白色念珠菌对上皮细胞的粘附有关。但是Leidich等［3］通过扫描电镜观察磷脂酶B缺陷型菌株和野生菌株对上皮细胞的粘附性时，并未发现二者有明显差异。因此，认为磷脂酶B仅直接损伤宿主细胞膜，并不直接影响白色念珠菌的粘附力。Samaranayake等人［12］通过研究HIV患者口腔念珠菌磷脂酶的活性与其他毒力因子的相关性时，也指出念珠菌磷脂酶B基因的表达与其他毒力因子没有明显的相关性。

　　4  展望
   
　　重要的临床致病真菌如白念珠菌、新生隐球菌及烟曲霉均产生磷脂酶B，说明此酶可能是在致病真菌中普遍存在的毒力因子［13］。因此我们应进一步深入研究磷脂酶B对宿主细胞侵害的具体机制，了解其致病机理，而有可能通过抑制该酶而进行念珠菌病的治疗。Chen等已首先鉴定了念珠菌磷脂酶的抑制因子并分析了这种能够抑制磷脂酶活性物质的结构。可以预测，以真菌磷脂酶为靶位点的研究开发等将具有广阔的研究前景。
   
　　多种致病真菌均可产生磷脂酶B。随着分子生物学研究的不断深入，念珠菌基因组全序列测定的完成［14］，以及各种亚型磷脂酶B的提纯和编码基因的克隆，我们可以生产出各种特异性的念珠菌磷脂酶B作为抗原抗体反应的抗原。应用该纯化的抗原与患者血清中的抗体结合，进行高度特异和敏感的诊断性实验，该血清学诊断方法，将能很好的解决传统单纯培养的阳性结果不能很好区分是正常寄生还是已经发生病的问题，做到对念珠菌病的早期诊断。
   
　　我们可以相信，磷脂酶B的研究成果将有助于进一步明确白色念珠菌的致病机制、耐药机制，为抗真菌药物的开发及白色念珠菌病的诊断和治疗等方面提供了新的前景。

【参考文献】
  　　［1］ 苏英,李春阳.敏感和耐药白念珠菌磷脂酶活力与其毒力关系的研究［J］. 2007, 45 (5); 535～537.

　　［2］ Ghannoum MA. Potential Role of Phospholipases in Virulence and Fungal Pathogenesis［J］. Clin Microbiol Rev, 2000,13(1):122～143.

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　　［14］ Enfert CD, Goyard S, Rodriguez-Arnaveilhe S, et al. Candida DB:agenome database for Candida albicans pathogenomics［J］.Nucleic Acids Research,2005,33:353～357.

作者单位：大理学院基础医学院医学微生物及免疫学教研室，云南 大理 671000