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【摘要】 目的 构建表达结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达系统，建立表达及纯化方法，为其应用打下基础。 方法 根据ESAT-6的基因序列设计引物，从结核菌基因组DNA中扩增基因，酶切后插入表达载体，测序证实后转入大肠杆菌JM109菌株，经IPTG诱导表达，产物经谷胱甘肽-琼脂糖凝胶法纯化。 结果 ESAT基因产物大小、酶切片断大小和载体的大小与设计一致、ESAT-6基因测序的结果与目的基因完全符合。表达纯化的蛋白的大小与蛋白质分子量标准比较一致。 结论 构建结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达载体成功，纯化出目的蛋白。
【关键词】 结核分枝杆菌 早期分泌性抗原靶-6 表达 纯化
结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，结核菌)引起的感染性疾病，对公共卫生的危害依然十分严重。对于结核病的控制，在健全的防控体系和化学药物治疗不能取得突出进展的情况下，采用新思路和新技术是发展的必由之路。一是在不断寻求无创、早期、快速的检测方法，另一个就是寻找具有免疫保护力更持久的新型疫苗。这两项技术的进步均离不开克隆表达蛋白质，并对其用于实验检测和预防进行研究。结核菌的早期分泌性抗原靶-6（Early secreting antigenic target-6, ESAT-6）是一种小分子蛋白，在检测和免疫保护方面的作用已得到试验的肯定［1,2］。本研究参照GenBank中结核菌H37Rv的ESAT-6基因序列设计引物，克隆、表达和纯化结核菌ESAT-6蛋白，为进一步研究其在结核病的诊断及疫苗研究中的应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 质粒和宿主菌 pMD 18-T载体购自大连宝生物工程公司。表达载体pGEX-6P-1、大肠杆菌JM109和DH5a株为海南大学生命科学和农学院作物遗传育种实验室保存。
1.2 结核菌标准株H37Rv 朱中元实验室保存，原菌株由武汉大学免疫学系刘君炎教授馈赠,基因组提取方法见文献［3］。
1.3 主要化学试剂 丙烯酰胺、琼脂糖、十二烷基硫酸钠(SDS)、异丙基硫代半乳糖(IPTG)为上海生工生物工程公司产品,GST琼脂糖凝胶购自北京卓冠科技有限公司；考马斯亮蓝快染液购自北京天为时代公司；Taq DNA聚合酶、DNA凝胶回收试剂盒、限制性核酸内切酶EcoR I和Xho I、DNA连接酶为大连宝生物工程公司产品；标准分子量DNA、标准分子量蛋白为TIANGEN公司产品。
1.4 ESAT-6基因的引物设计与扩增 根据GenBank中结核菌H37Rv ESAT-6基因的序列设计合成引物，上游和下游引物的5’端分别引入EcoR I和Xho I酶切位点。上游引物EcoR I-ESAT-6-R:5’-GAATTCATGACAGAGCAGCAGTGGAAT-3’，下游引物Xho I-ESAT-6-L:5’-CTCGAGTTGCAGCGCGTTGTTCAGCT-3’。扩增esat-6的反应体系基本同文献［4］。
1.5 表达载体的构建 技术步骤详见参考文献［3］。ESAT-6与质粒p-GEX-6P-1分别酶切后，凝胶电泳，切下特异片段，纯化，连接后分别转染大肠杆菌JM109和DH5a。
1.6 表达载体的鉴定 采用3种方法鉴定，分别是从载体中扩增ESAT-6，表达载体的酶切鉴定和基因序列分析鉴定。
1.7 表达产物的诱导表达 接种阳性细菌至含氨苄青霉素的LB培养基中,37℃培养(OD600约0.6)4～6h。取少量培养物至离心管中，4℃下12 000rpm离心1min，弃去上清液（沉淀作为空白对照）。加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，摇菌速度为230rpm，37℃培养3h。每隔1h收集菌体至微量离心管中，4℃下12 000rpm离心1min，弃上清。
1.8 表达产物的纯化 收集细菌沉淀，加入适量PBS和苯甲基磺酰氟（PMSF）至终浓度5mg/ml，DTT至终浓度5mg/ml，Tween20至终浓度10mg/ml，溶菌酶至终浓度10mg/ml，摇匀，酶解1～2h。在冰上用超声波处理。将裂解液离心取上清去沉淀。将谷光甘肽-琼脂糖树脂4ml加入到裂解上清液，放置于4℃下230rpm摇床振荡2～3h。再离心弃上清，加入清洗液PBS使其均匀，进行离心4 000rpm，5min，弃上清，重复5次。在沉淀中加入清洗液GST 660μl放置于4℃下230rpm摇床振荡10min，取出进行离心4 000rpm，5min，收集清洗液即为纯化的蛋白。
1.9 表达产物的鉴定 纯化蛋白进行12% SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色液染色，观察结果。
2 结果
2．1 ESAT-6基因的扩增与克隆 从结核菌总DNA中扩增出大小约210bp的DNA片段,与ESAT-6基因的大小一致，见图1。目的基因片段与载体pMD-18-T进行连接。菌落PCR鉴定，重组目的片段大小与预期相符。
图1 ESAT-6基因的PCR扩增图（略）
M:DNA分子量标准; 1.PCR产物
2.2 原核重组表达质粒的构建与鉴定 重组子的菌落PCR获得了大小约210bp的插入片段,与ESAT-6基因的大小相符，见图2。
图2 重组质粒pGEX-6P-1-ESAT-6的PCR鉴定（略）
M:DNA分子量标准; 1.从克隆菌扩增的esat-6
2.3 ESAT-6基因的测序分析 通过Prime Primier 5.0软件比对，发现从E6-PG转染的DH5a提取的质粒，测序后序列与GST和ESAT-6的序列完全符合，起始位点后的氨基酸序列与文献报道的相符。
2.4 重组ESAT-6融合蛋白的表达与鉴定 挑取单菌落，于28℃和37℃下分别培养，待菌体浓度达到要求后，加入IPTG 至终浓度3.0μg/ml。然后隔1h、2h、3h提取样品,进行SDS-PAGE电泳。鉴定表明，目的基因蛋白相对分子质量约为32KD,和预期结果相符，1～3h内随着诱导时间蛋白量逐渐增加，3h以后蛋白量增加不明显，即诱导3h以后，接近最高表达量。见图3。表达的重组菌的裂解液经12% SDS-PAGE分离、染色后，在约32kDa处出现一条强的诱导表达带。
图3 克隆菌不同诱导时间ESAT-6含量比较（略）
M:蛋白分子量标准; CK:未经IPTG诱导,即空白对照; A-C:经IPTG分别诱导1h、2h、3h、的表达产物
2.5 重组ESAT-6蛋白的纯化 经IPTG诱导的转化菌裂解上清,同谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析纯化后,SDS-PAGE显示得到的蛋白为约32kDa的蛋白带，见图4。
图4 纯化ESAT-6蛋白的电泳结果（略）
M:蛋白分子量标准; 1.重组菌表达产物; 2.纯化ESAT-6蛋白
3 讨论
结核菌分泌多种蛋白到细胞外,在抗结核免疫起重要作用。一些研究证明结核菌培养滤液中所含的抗原是保护性免疫反应的靶抗原。ESAT-6是存在于结核菌短期培养滤液中的分泌性蛋白,在结核病人体内能被机体识别［1,2］。它是由结核菌RD1位点上的ESAT-6基因编码，全长95个氨基酸,理论分子量为9.9kDa,经SDS-PAGE测得其分子量为6kDa,故而得名［5］。编码基因ESAT-6全长210bp,仅存在于致病性分枝杆菌中，BCG及其它非致病性分枝杆菌缺乏该基因，因而不能表达ESAT-6蛋白［6］。ESAT-6在结核菌感染早期即能被机体的免疫系统所识别,可诱导机体的抗原特异性细胞增殖，在保护性细胞免疫反应中发挥作用［7］。因此ESAT-6是一种免疫保护性抗原,可作为新型结核病疫苗研制的候选分子。
采用原核融合表达方式在大肠杆菌中表达外源基因是目前普遍采用的一种高效表达方式。本实验利用原核表达的融合蛋白的稳定性好,不易被细菌蛋白酶降解,表达的蛋白溶解性好，有利于纯化（通过谷胱甘肽-琼脂糖柱进行亲和层析）,从而获得目的蛋白。
本实验中纯化表达蛋白克服了不利因素的影响，取得了预期的效果。影响纯化的因素很多。首先是重组菌表达的效果，而重组菌的表达受载体、诱导温度、诱导剂浓度等因素的影响。第一个因素是表达载体，不同的外源基因要与不同的载体相匹配。我们使用的表达载体pGEX-6P-1合适，表达效率高。温度也是一个重要影响因素，即使是同一种表达载体和表达的菌株，不同的外源基因表达需要的温度差别也很大。本实验采取28℃和37℃两个温度，由图3和图4可以看出，表达量有一定的差别，37℃表达由于28℃表达。再者，纯化过程中要掌握好PBS、PMSF、DTT的使用，防止蛋白被降解，导致蛋白的得率下降。实验表明，构建的E6-PG克隆菌株在37℃下表达效果较好，在IPTG终浓度为0.5mmol/L下诱导3h即达到最大表达量。
我们构建的表达载体E6-PG为融合表达载体，即表达GST和ESAT-6的融合蛋白。所以表达产物的分子量为32kDa，原因是GST为26kDa,ESAT-6为6kDa。这样做的优势一是表达的产物稳定，二是便于使用谷胱甘肽-琼脂糖柱进行亲和层析纯化目的蛋白，三是GST的免疫原性弱，不会造成利用ESAT-6作为捕获蛋白进行检测的特异性降低。该研究为ESAT-6作为诊断抗原和疫苗研究打下了基础。
【参考文献】
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［2］ Harboe M, Malin AS, Dockrell H, et al. B-Cell epitopes and quantification of the ESAT-6 protein of Mycobacterium tuberculosis［J］. Infect Immun, 1998,66(2):717～723.
［3］ 朱中元, 王海波, 谢勇, 等. 结核分枝杆菌耐异烟肼基因检测芯片的研究［J］. 中华检验医学杂志, 2007,30:872～877.
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［5］ Ulrichs T, Munk ME, Mollenkopf H, et al. Differential T cell responses to Mycobacterium tuberculosis ESAT6 in tuberculosis patients and healthy donors［J］. Eur J Immunol, 1998, 28: 3949～3958.
［6］ Behr MA, Wilson MA, Gill WP, et al. Comparative genomics of BCG vaccines by whole genome DNA microarray［J］. Science, 1999,284: 1520～1523.
［7］ Pollock JM and Andersen P. Predominant recognition of the ESAT-6 protein in the first phase of interferon with Mycobacterium bovis in cattle［J］. Infect Immun, 1997, 65: 2587～2592.
作者单位：海南大学农学院,海南 海口 570208; 海南医学院附属新华医院,海南 海口 570311