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【摘要】 目的 建立PCR-RFLP技术鉴定ABO血型基因型的方法。 方法 应用PCR技术扩增ABO基因第六外显子上分别包含258位核苷酸和700位核苷酸的两个DNA片段,分别用KpnI和AluI酶解PCR扩增产物,电泳分离鉴定ABO血型基因型,同时对上述两种PCR扩增的DNA片段进行序列测定。 结果 用PCR-RFLP技术鉴定的ABO基因分型结果与PCR扩增产物的序列测定结果完全符合,可鉴定出AA、AB、AO、BB、BO、OO等6种ABO血型基因型。 结论 PCR-RFLP技术操作简便,重复性和稳定性好,可作为鉴定ABO血型基因型的可行方法。
【关键词】 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP) ABO血型 ABO基因 基因分型
ABO血型是人类发现的第一个血型系统,作为一种遗传标记,是研究人类种族起源、融合、同化及民族间的亲缘关系的一个极为重要的指标,在临床输血、法医物证检验等领域有着重要意义。在分子生物学技术被应用于免疫血液学研究中之前,ABO基因型的鉴定一直是通过血清学方法和家系调查来进行。1990年Yamamoto等[1]克隆出了糖基转移酶的基因DNA,使ABO血型基因型的检测成为可能。笔者采用PCR-RFLP技术,建立了一种简便、快速ABO血型基因型检测的方法,现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 DNA样品 用EDTA抗凝,从海南省海口市、文昌市随机采集海南籍汉族正常人群无关个体的血液样本255份,按Lahiri等方法[2]提取DNA。
1.2 血型血清学检测 采用试管法进行ABO表型检测,参照试剂盒说明进行操作。检测试剂盒为长春生物制品研究所产品。
1.3 PCR扩增ABO基因
1.3.1 引物的设计与合成 从Genbank中获得人类ABO血型基因的DNA全序列和mRNA序列,用PCR DESN软件辅助设计引物,并委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成,引物序列如下:
引物1 5’- TGGGCGTGGAGATCCTGAC -3’
引物2 5’- GCACCGACCCCCCGAAGA-3’
引物3 5’- GACCGCACGCCTCTCTCCA -3’
引物4 5’- ACCTTTCCCATCTACCCTCT -3’
1.3.2 PCR扩增 ABO基因扩增分为两套扩增体系,引物1和引物2扩增包括ABO基因700位核苷酸的DNA特异片段,引物3和引物4扩增包括ABO基因258位核苷酸的DNA特异片段。
两套PCR反应体系均为25μl,在PCR缓冲液(10mmol/L Tris-HCl,pH8.3,50mmol/L KCl,1.0mol/L MgCl2,0.01% Gelatin)中含模板DNA 0.2μg,每种引物0.2~0.5μmol/L,每种dNTP为200μmol/L,在加入0.75U Taq DNA聚合酶(北京天根公司产品)后,置Tgradient 96梯度PCR仪中扩增。
引物1和引物2 PCR扩增的循环参数为:94℃ 50s,59℃ 50s,72℃ 1min 30s,重复循环31次。引物3和引物4 PCR扩增的循环参数为:94℃ 50s,52℃ 50s,72℃ 1min 30s,重复循环31次。
1.3.3 PCR扩增片段的酶切分析 引物1/引物2和引物3/引物4扩增的DNA特异片段,分别用限制性内切酶AluI和KpnI酶切,反应体系为15μl PCR扩增产物反应液,2μl 10×buffer,AluI和KpnI各5U,无菌双蒸水补至20ul,置37℃酶切过夜。将酶切产物在3%的琼脂糖凝胶中电泳,经EB染色在UVI band(英国UVI tec 公司产品)凝胶成像系统中观察结果并照相。用上述建立的PCR-RFLP技术对255例海南汉族人样本DNA进行了ABO血型基因的分型检测。
1.4 ABO基因PCR扩增特异DNA片段的测序 随机抽取经上述建立的PCR-RFLP技术检测后分型出的6种ABO血型基因型即AA、AB、AO、BB、BO、OO基因型的DNA样本,将引物1/引物2、引物3/引物4 的PCR扩增特异DNA片段,送上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA序列测定。
2 结果
2.1 PCR扩增片段、酶切片段的检测 引物1和引物2扩增的包含有ABO基因700位核苷酸的DNA特异片段为165bp, 用AluI(5’-AG↓CT-3’)消化此扩增片段,可酶切成不同长度DNA片段,即165bp、119bp和46bp的DNA片段(46bp的DNA片段太小,琼脂糖凝胶电泳结果无法观察到)。119bp片段为纯合的BB基因型,165bp/119bp混合片段为含B基因的AB、BO基因型,165bp片段为不含B基因的AA、AO或OO基因型。引物3和引物4扩增的包含有ABO基因258位核苷酸的DNA特异片段为296(295)bp, 用KpnI(5’-GGTAC↓C-3’)消化此扩增片段,可酶切成不同长度DNA片段,即296bp、246bp和49bp的DNA片段(49bp的DNA片段太小,琼脂糖凝胶电泳结果无法观察到)。296bp片段为不含O基因的AA、AB或BB基因型, 296bp/246bp混合片段为含O基因的AO、BO基因型,246bp片段为纯合的OO基因型(见图1~3)。ABO血型6种基因型的限制性内切酶酶切分析结果归纳为表1。
图1 ABO基因PCR扩增结果(略)
M为100bp DNA Ladder(北京天根公司产品); 1~6为引物3和引物4扩增的包含有ABO基因258位点的DNA特异片段; 7~12为引物1和引物2扩增的包含有ABO基因700位点的DNA特异片段。
Fig 1 The PCR amplified results of ABO gene
M: DNA marker (100bp DNA Ladder); 1~6: The fragment including 258 locus of ABO gene with primer 3 and primer 4; 7~12: The fragment including 700 locus of ABO gene with primer 1 and primer 2.
图2 AA、AO、AB血型基因型PCR扩增产物AluⅠ和KpnⅠ酶切结果(略)
M为100bp DNA Ladder(北京天根公司产品); 1~2为AA基因型样本; 3~4为AO基因型样本; 5~6为AB基因型样本。
Fig 2 Digestions of the PCR products of AA, AO and AB genotypes by AluⅠ and KpnⅠ
M: DNA marker (100bp DNA Ladder); 1~2: The sample of AA genotypes; 3~4: The sample of AO genotypes; 5~6: The sample of AB genotypes.
图3 BB、BO、OO血型基因型PCR扩增产物AluⅠ和KpnⅠ酶切结果(略)
M为100bp DNA Ladder(北京天为公司产品); 1~2为BB基因型样本; 3~4为BO基因型样本; 5~6为OO基因型样本。
Fig 3 Digestions of the PCR products of BB, BO and OO genotypes by AluⅠ and KpnⅠ
M: DNA marker (100bp DNA Ladder); 1~2: The sample of BB genotypes; 3~4: The sample of BO genotypes; 5~6: The sample of OO genotypes.
2.2 255例海南汉族人样本ABO血型基因型分布及等位基因频率结果见表2。
2.3 ABO基因PCR扩增特异DNA片段的测序结果 A、B、O三个ABO血型等位基因的cDNA在258、700、793、800位点脱氧核糖核苷酸上存在差异(见表3),引物1和引物2扩增的165bp DNA特异片段包含有ABO基因700、793、800这3个脱氧核糖核苷酸位点, 引物3和引物4扩增的296bp DNA特异片段包含有ABO基因258这一脱氧核糖核苷酸位点,对上述2个DNA特异片段进行测序,根据这4个脱氧核糖核苷酸位点测序结果的不同,即可鉴定出6种不同的ABO血型基因型。
表1 ABO血型6种基因型的限制性内切酶酶切分析结果(略)
Tab 1 The results of digestion of six ABO blood type samples
表2 海南汉族人ABO血型基因型分布及等位基因频率(略)
Tab 2 The genotyping and frequency of ABO gene in Han nationality of Hainan province
表3 ABO基因cDNA上的差异(略)
Tab 3 cDNA difference of the ABO gene
注:*O基因258位点缺失G,后面的A前移。
2.3.1 AA基因型样本ABO基因PCR扩增特异DNA片段的测序结果 以下测序结果显示该样本ABO基因的cDNA在258、700、793、800位点脱氧核糖核苷酸分别是G、G、C、G,测序结果表明该样本为AA基因型,PCR-RFLP技术的基因分型结果与DNA测序结果相符。见图4。
图4 AA基因型样本ABO基因PCR扩增特异DNA片段的测序结果(略)
A)为700脱氧核糖核苷酸位点测序结果;B)为793和800脱氧核糖核苷酸位点测序结果;C)为258脱氧核糖核苷酸位点测序结果。
Fig 4 Sequencing maps of PCR product of AA genotypes
A)Sequencing map of 700 locus; B)Sequencing map of 793 and 800 locus; C)Sequencing map of 258 locus.
2.3.2 BB基因型样本ABO基因PCR扩增特异DNA片段的测序结果 以下测序结果显示该样本ABO基因的cDNA在258、700、793、800位点脱氧核糖核苷酸分别是G、A、A、C,测序结果表明该样本为BB基因型,PCR-RFLP技术的基因分型结果与DNA测序结果相符。见图5。
图5 BB基因型样本ABO基因PCR扩增特异DNA片段的测序结果(略)
A)为700脱氧核糖核苷酸位点测序结果;B)为793和800脱氧核糖核苷酸位点测序结果;C)为258脱氧核糖核苷酸位点测序结果。
Fig 5 Sequencing maps of PCR product of BB genotypes
A)Sequencing map of 700 locus; B)Sequencing map of 793 and 800 locus; C)Sequencing map of 258 locus.
2.3.3 AB基因型样本ABO基因PCR扩增特异DNA片段的测序结果 以下测序结果显示该样本ABO基因的cDNA在258、700、793、800位点脱氧核糖核苷酸分别是G、G/A、C/A、G/C,测序结果表明该样本为AB基因型,PCR-RFLP技术的基因分型结果与DNA测序结果相符。见图6。
2.3.4 OO基因型样本ABO基因PCR扩增特异DNA片段的测序结果 以下测序结果显示该样本ABO基因的cDNA在258、700、793、800位点脱氧核糖核苷酸分别是A、G、C、G,测序结果表明该样本为OO基因型,PCR-RFLP技术的基因分型结果与DNA测序结果相符。见图7。
图6 AB基因型样本ABO基因PCR扩增特异DNA片段的测序结果(略)
A)为700脱氧核糖核苷酸位点测序结果;B)为793和800脱氧核糖核苷酸位点测序结果;C)为258脱氧核糖核苷酸位点测序结果。
Fig 6 Sequencing maps of PCR product of AB genotypes
A)Sequencing map of 700 locus; B)Sequencing map of 793 and 800 locus; C)Sequencing map of 258 locus.
图7 OO基因型样本ABO基因PCR扩增特异DNA片段的测序结果(略)
A)为700脱氧核糖核苷酸位点测序结果;B)为793和800脱氧核糖核苷酸位点测序结果;C)为258脱氧核糖核苷酸位点测序结果。
Fig 7 Sequencing maps of PCR product of OO genotypes
A)Sequencing map of 700 locus; B)Sequencing map of 793 and 800 locus; C)Sequencing map of 258 locus.
2.3.5 AO基因型样本ABO基因PCR扩增特异DNA片段的测序结果 以下测序结果显示该样本ABO基因的cDNA在258、700、793、800位点脱氧核糖核苷酸分别是G/A、G、C、G,测序结果表明该样本为AO基因型,PCR-RFLP技术的基因分型结果与DNA测序结果相符。
图8 AO基因型样本ABO基因PCR扩增特异DNA片段的测序结果(略)
A)为700脱氧核糖核苷酸位点测序结果;B)为793和800脱氧核糖核苷酸位点测序结果;C)为258脱氧核糖核苷酸位点测序结果。
Fig 8 Sequencing maps of PCR product of AO genotypes
A)Sequencing map of 700 locus; B)Sequencing map of 793 and 800 locus; C)Sequencing map of 258 locus.
2.3.6 BO基因型样本ABO基因PCR扩增特异DNA片段的测序结果 以下测序结果显示该样本ABO基因的cDNA在258、700、793、800位点脱氧核糖核苷酸分别是G/A、A、A、C,测序结果表明该样本为BO基因型,PCR-RFLP技术的基因分型结果与DNA测序结果相符。见图9。
3 讨论
ABO血型系统是1901年由Landsteiner首先发现的第一个人类遗传标记,但其分子遗传机理直到1990年才由Yamamoto F等[3]研究清楚,ABO基因定位于染色体9q34上,该基因有A、B、O 3个等位单拷贝基因,ABO血型系统的核苷酸序列高度保守,ABO血型基因之间只有几个核苷酸的差异,有着高度的同源性。A基因与B基因之间在cDNA上有7个单碱基替换:A294G、C523G、C654T、G700A、C793A、G800C和G927A,O基因与A基因相比只是cDNA的第258位的胞嘧啶缺失,出现框移突变,使第352位的TTA变成了TAA(终止密码子),提前终止了转移酶的合成,导致合成的转移酶没有活性区。
图9 BO基因型样本ABO基因PCR扩增特异DNA片段的测序结果(略)
A)为700脱氧核糖核苷酸位点测序结果;B)为793和800脱氧核糖核苷酸位点测序结果;C)为258脱氧核糖核苷酸位点测序结果。
Fig 9 Sequencing maps of PCR product of BO genotypes
A)Sequencing map of 700 locus; B)Sequencing map of 793 and 800 locus; C)Sequencing map of 258 locus.
本文选择了G700A和258G缺失作为2个特异性限制酶识别位点。引物1和引物2扩增的包含有ABO基因700位碱基的DNA特异片段为165bp, A、O基因均为700G,无AluI识别位点,但B基因为700A,产生AluI识别位点(5’-AG↓CT-3’),酶切后可产生119bp和46bp的DNA片段(46bp的DNA片段太小,琼脂糖凝胶电泳结果无法观察到),因此,有119bp片段的出现则说明有B基因的存在。引物3和引物4扩增的包含有ABO基因258位碱基的DNA特异片段为296(295)bp, A、B基因扩增片段为296bp,无KpnI识别位点,而O基因258位碱基G的缺失既产生了KpnI(5’-GGTAC↓C-3’)的识别位点,酶切后产生246bp和49bp的DNA片段(49bp的DNA片段太小,琼脂糖凝胶电泳结果无法观察到),所以若有246bp片段出现则说明有O基因的存在。图2~3的实验结果表明,本文建立的PCR-RFLP技术能准确地鉴定出AA、AB、AO、BB、BO、OO 6种ABO血型基因型,其基因分型结果与DNA测序结果完全相符,基因分型结果的特异性和准确率均为100%。
作者用PCR-RFLP技术对255例海南汉族人样本ABO血型基因型分布及等位基因频率进行了分析,实验结果表明,在海南汉族人中A、B、O基因频率分别为0.208、0.212、0.580,其中AA基因型14例(6.27%),AB基因型13例(6.27%),AO基因型39例(22.75%),BB基因型13例(6.27%),BO基因型42例(23.53%),OO基因型68例(34.90%)。海南汉族人中A、B、O基因频率经χ2检验符合Hardy-Weinbery遗传平衡。255例海南汉族人血样基因型的PCR-RFLP技术检测结果与血清学检测结果全部符合,证实本法分型稳定,重复性好。
ABO血型系统是第一个被发现的人类遗传标记系统,在输血、亲子鉴定、人类学研究、法医物证检验等领域中有着非常重要的应用价值,本文建立的PCR-RFLP技术分型稳定,具有重复性好、特异性和准确率均较高的特点,为临床开展ABO血型基因型的鉴定提供了简便、快速、准确的基因分析方法。
【参考文献】
[1] Yamamoto F, Marken J, Tsuji T, et al. Cloning and characterization of DNA complementary to human UDP-Gal NAC:Fuc alpha 1-2 Gal alpha 1-3GalNAC transferase (histo-blood A transferase) mRNA[J].J Biol Chem, 1990,265:1146~1151.
[2] Lahiri DK, Schuabel B. DNA isolation by arapid method from human blood samples:Effects of MgCl2, EDTA, storage time, and temperature on DNA yield and quality[J]. Biochem Genet, 1993,31(718):321~328.
[3] Yamamto F, Clausen H, White T ,et al. Molecular genetic basis of the histo-blood group ABO system[J]. Nuture, 1990, 345(6272):229~330.
作者单位:海南医学院,海南 海口 571101; 海南医学院附属医院儿科,海南 海口 571101