流感病毒对MDCK细胞核转录因子表达的影响

【摘要】  目的 研究流感病毒刺激对体外培养的MDCK细胞核转录因子表达的影响，探讨流感病毒损伤细胞的分子学机制。 方法 体外培养获得MDCK细胞，分别用NF-κB免疫组化方法和TransAM P65试剂盒测定血凝滴度1：64的A型流感病毒H1N1和H3N2两种亚型、B型流感病毒、紫外线照射灭活的B型流感病毒NF-κB蛋白表达和活性的动态变化。以细胞激活剂佛波酯刺激后的MDCK细胞为阳性对照，以等量生理盐水为阴性对照。 结果 各组细胞加入不同的流感病毒后，与对照组相比，细胞免疫组化显示NF-κB随流感病毒作用相同时间后结果出现明显差异；各组相比，B型流感病毒作用72h对NF-κB的激活作用最明显，而A型两种亚型之间无显著差异。TransAM P65试剂盒测定也得出相同的结果。 结论 流感病毒可激活体外培养MDCK细胞的核转录因子，且这种作用随时间而增强。

【关键词】  MDCK细胞 流感病毒 核转录因子

流感病毒能够引起多种禽类、哺乳动物和人的流行性感冒。根据其内部核蛋白（NP）和基质蛋白（M）抗原性不同，可分为A、B、C三型，但其致病机理尚不完全明确。MDCK（Madin Darby Canine Kidney）细胞是目前实验室用来分离流感病毒的最常用的传代细胞株，对A型流感病毒各亚型和B型流感病毒均高度敏感。核转录因子kB(NF-kB)是存在于多种细胞胞浆中能调节多种炎症和免疫基因表达的一种重要的转录调节因子，可被病毒、氧化剂、炎症细胞因子等激活进入细胞核［1～4］。本文以MDCK细胞为靶细胞，NF-kB为靶点，初步探讨流感病毒的致炎和致病机理。

　　1  材料和方法

　　1.1  主要材料  MDCK细胞由江苏省疾病预防控制中心流感实验室赠送，Pn+15代；实验的各流感病毒株均为泰州市疾病预防控制中心流感实验室分离，经RT-PCR鉴定分型，-80℃保存。

　　1.2  方法

　　1．2.1  MDCK细胞培养［4,5］  DMEM培养液190ml加入胎牛血清20ml，青链双抗2ml，7.5％NaHCO3调节pH为7.4，上述各组分混匀为MDCK完全培养液，取Pn+15代细胞瓶，加入消化液适量，以恰好盖过细胞为宜，轻放于37℃培养箱中约10min，待细胞圆缩，彼此互不相联时，轻轻吸弃消化液，加入培养液，反复轻吸吹打，至细胞脱壁，变匀，计数细胞1.0×105/ml接种于新的25ml培养瓶中，置37℃、5%CO2环境静置培养。

　　1．2．2  流感病毒培养及滴度测定［5］  将流感病毒接种于9～11日龄鸡胚尿囊腔，35℃孵育48～72h,然后将鸡胚置4℃冰箱过夜，次日收获尿囊液，3 000rpm离心10min，弃去沉淀，取上清液进行血凝实验，确定其滴度大于1:64者收获上清液，-80℃保存。

　　1．2．3  流感病毒感染细胞  培养细胞传代并计数，转移至6孔培养板中，调整每孔细胞密度为1.0×105/ml。取H1N1亚型、H3N2亚型和B型流感病毒和用紫外线照射30min的B型流感病毒1ml分别加入到其中A～D孔细胞中， E孔加入等量生理盐水作阴性对照，F孔加入细胞激活剂佛波酯作阳性对照。每孔培养体系最终体积调整为5ml,A～F孔细胞孵育分12、24和72h共3组，每组再重复5次。另取6孔板用于细胞免疫组化，预先在培养孔内加入盖玻片，分组情况同上。

　　1．2．4  细胞活力测定  取细胞悬液0.5ml加入试管,加入0.5ml 0.4%台盼蓝染液，染色2～3min。吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片；镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力；死细胞能被台盼蓝染上色，镜下可见深蓝色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。活细胞百分数=活细胞数/总细胞数×100％

　　表1  流感病毒对MDCK细胞活力的影响（略）

　　注:NC为生理盐水，作阴性对照; 和对照组比较，△P＜0.05, *P＞0.05。

　　1．2．5  免疫组织化学和S-P染色  在0、12、24、72h各时相点分别挑取玻片,用0.1mol/LPBS漂洗3次,加4%多聚甲醛50μl固定40min,0.1mol/LPBS漂洗3次,3%过氧化氢室温下10min,0.1mol/LPBS漂洗3次,加5%山羊血清于37℃静置30min,吸弃血清,加1:100稀释的P65抗体，于37℃静置3h，4℃过夜,0.1mol/L PBS 漂洗3次,加生物素标记的二抗(Ig/Bio 1∶20)37℃静置2h,用0.1mol/L PBS漂洗3次,加HRP/SP(1:100)复合物于37℃培养2h,0.1mol/L PBS漂洗3次,DAB法显色5min,脱水、透明、DPX封片,免疫组化检测对照:用血清稀释液代替一抗,其余步骤同前。以高倍镜观察，细胞核区出现棕黄色颗粒，且总的染色面积与对照组比较，大于30%以上者为阳性，其余判为阴性。

　　1．2．6  核蛋白的提取  使用Active Motif公司的核蛋白提取试剂盒，方法参照使用手册。

　　1．2．7  NF-κB活性测定  用美国motif公司的TrasAM P65试剂盒进行测定，首先使样本中的NF-kB和96孔板上包被的寡苷酸结合；室温孵育1h，洗板3次，结合一抗，室温静置孵育1h，洗板3次，结合二抗，室温静置孵育1h，洗板4次，加入显色剂显色， 室温避光孵育5min， 然后每孔加100μl终止液，此时蓝色变黄，5min内读板，设定波长为450nm。

　　1．3  统计学处理  所得结果数据用x±s表示,采用spss12.0分析，设立对照组，多组间比较采用双因素重复试验方差分析，多组间两两比较采用SNK检验,P<0.05为有显著意义。

　　2  结果

　　2．1  流感病毒作用不同时间对细胞活力的影响  台盼蓝染色发现，H1N1、H3N2和B型流感病毒分别作用于MDCK细胞不超过12h，活细胞百分数即台盼蓝拒染率很高，与生理盐水对照组无差异（P＞0.05），提示作用12h内流感病毒对细胞活性无明显影响；但随时间延长，流感病毒作用12～72h，活细胞百分数随时间而逐渐下降，提示细胞活力下降；作用72h后，细胞拒染率明显降低，死亡细胞数已多于活细胞数（表1）。

　　2．2  NF-κB免疫组织化学检测结果  正常培养的MDCK， P65蛋白主要位于细胞浆内，细胞核周围，S-P染色呈阴性；加入细胞激活剂PMA 12h后，P65蛋白转移入细胞核内，染色呈阳性；流感病毒加入12h后，P65蛋白位于细胞核内，染色呈阳性，这一结果证实了流感病毒对细胞核转录因子的激活作用（图1）。

　　图1  NF-κB免疫组织化学分析结果（S-P×400）（略）

　　A：MDCK细胞加入PMA 12h后，P65蛋白在细胞核区表达阳性；B：加入B型流感病毒12h后，P65蛋白在细胞核区表达阳性；C：静息状态下，P65蛋白在细胞核区表达阴性。

　　2．3  NF-κB活性指标（用450nm处的吸光值表示）  与对照组比较，紫外线照射30min B型流感病毒组NF-κB活性无明显改变。B型、H3N2亚型、H1N1亚型作用组，NF-κB活性均显著提高（P＜0.05），其中Ｂ型病毒作用72h的激活作用最显著，而H1N1亚型、H3N2亚型作用组差别不显著(表2)。

　　3  讨论
   
　　本实验通过流感病毒作用于MDCK细胞后不同时间台盼蓝染色发现，三种型别的流感病毒处理MDCK细胞不超过12h，活细胞百分数即台盼蓝拒染率很高，提示短时间作用下流感病毒对细胞活性无明显影响，可能与此时细胞的调控系统作用一过性增强有关；但随时间延长作用24h组、72h组，活细胞百分数随时间而逐渐下降，提示流感病毒的长时间作用对MDCK细胞有明显毒性作用。而作用大于72h后，细胞拒染率明显降低，死亡细胞数已多于活细胞数，提示细胞调控机制失效。

　　表2  NF-κB活性比较（略）

　　注:F组为阴性对照，与对照组比较，△P＜0.05,*P＞0.05。   

　　细胞在静息状态下，NF-κB呈结合状态位于细胞浆内。在流感病毒持续刺激下免疫组化显示，NF-κB被激活，大量进入核内，染色呈阳性，而紫外线照射灭活的流感病毒则无此改变。这与TrasAM P65试剂盒定量测定结果一致。以上证实了存活态流感病毒对MDCK细胞NF-κB有激活作用。进一步实验证实这种作用随时间而增强。
   
　　本实验对于NF-κB活性测定，由于条件限制未采用经典的凝胶迁移滞后实验（Electrophoretic mobility shift assays，EMSA），请关注此研究者重复。上述结论可能提示了流感病毒致病的一种分子学途径，也为流感的治疗提供了一个抗炎靶点。但在人体的纤毛上皮细胞和上呼吸道的表皮细胞是否也能得出相似结论，需要进一步研究。

【参考文献】
  　　［1］ Regnier CH, Song HY, Gao Xiong, et al. Identification and characterization of an IκB kinase［J］.Cell,1997,90:373～383.

　　［2］ Baeuerle PA. IκB-NF-κB structure: at the interface of inflammation control［J］. Cell,1998,95:729～731.

　　［3］ Huxford T, Hwang DB, Malek S,et al. The crystal of the IκBα/ NF-ΚB complex reveals mechanism of NF-ΚB inactivation［J］. Cell,1998,95:759～770.

　　［4］ Walter J. Wurzer, Christina Ehrhardt, Stephan Pleschka,et al. NF-B-dependent Induction of Tumor Necrosis Factor-related Apoptosis-inducing Ligand (TRAIL) and Fas/FasL Is Crucial for Efficient Influenza Virus Propagation［J］. J. Biol, Chem.2004,279(30): 30931～30937.

　　［5］ 中国疾病预防控制中心.全国流感/人禽流感监测实施方案(2005～2010年度)［M］.2005,9.

　　［6］ 郭元吉,程小雯. 流行性感冒及其实验技术［M］. 北京:中国三峡出版社, 1997,87～102.

作者单位：泰州市疾病预防控制中心微生物检验科，江苏 泰州 225300