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【摘要】 目的 比较彗星试验和微核试验测试颗粒物提取物遗传毒性的敏感性。 方法 采集广州市总悬浮颗粒物(TSP)和可吸入颗粒物(PM10)样品，用彗星试验(Comet assay)和微核试验方法（CBMN，Cell Blocked Micronucleus）评价广州市大气颗粒物中不同组份的有机物对淋巴细胞DNA的损伤。 结果 在0、4、12、20m3 eq/ml剂量下彗星试验均呈现剂量-效应关系，而同剂量下微核试验则没有剂量-效应关系。 结论 在颗粒物提取物的遗传毒性研究中，彗星试验较微核试验敏感。
【关键词】 颗粒物 遗传毒性 彗星试验 可提取有机物
流行病学研究表明大气颗粒物与人体健康有着密切的联系，随着颗粒物暴露量的增加，肿瘤和心血管疾病发病率和死亡率增加。可吸入颗粒物PM10及细粒子PM2.5等，能经呼吸进入支气管、肺部并产生沉积，甚至可以穿过肺泡而进入血液，是肺心病的主要诱因之一。这些颗粒物上有大量有害于人体健康的遗传毒性物质，具有致癌和促癌作用［1］。对珠三角中心城市广州市的颗粒物的研究表明，有较高的暴露水平和有机毒物污染水平。尽管颗粒物污染已成为珠三角主要的区域环境问题，但目前仍缺少对广州市颗粒物的遗传毒性研究。微核作为广泛采用的生物标志物之一。微核试验方法在敏感性、特异性和准确性方面，与经典的染色体畸变分析方法基本相当，已在化学品的遗传毒性监测中得到广泛的应用［2］。而彗星试验方法同样有着灵敏、灵活、需要样品量少、试验周期短、且简易廉价的优点。经过近10年的发展，目前彗星试验已成为研究污染物遗传毒性的基本方法之一［3］。基于广州颗粒物遗传毒性研究的现状，我们在市区采集TSP和PM10样品，对颗粒物有机总抽提物和由填充色谱柱分离得到的芳烃组份，进行人血淋巴细胞的彗星试验和微核试验的比较测试，同时对这些组分的化学组成成分进行了定性和定量的测定。
1 材料和方法
1.1 样品采集 在广州市五山的一楼顶采集PM10和TSP两种粒径颗粒物，采样地点周围无明显污染源。采样时间为2005年春季，每张滤膜连续采样24h。所用采样器为TH2000标准大流量采样器，采样前校正流量。采样滤膜为Watman（20.3cm×25.4cm，EP2000）玻璃纤维滤膜，具体采样方法与文献［4］相同。
1.2 样品处理 将采到的同一粒径样品进行合并，并把所得颗粒物样品分成两部分，一部分用于毒性测试，一部分用于化学分析。毒性测试的有机组份用二氯甲烷超声提取得总抽提物（编号00），总抽提物再经硅胶层析柱分别由正己烷、正己烷和二氯甲烷混和液（体积比1：1）、甲醇淋洗层析柱子，分离分别得到烷烃（编号01）、芳烃（编号02）和非烃化合物（编号03）三种不同的组份。取总抽提物和芳烃组份为染毒物质，分别将其浓缩并溶于DMSO（二甲基亚砜）中成为染毒原液。为方便比较，本文毒性试验部分有机提取物浓度均以每毫升培养液中加入相对应空气体积中的颗粒物提取物表示（m3 air eq/ml）。
1.3 彗星试验 彗星试验方法参见文献［4］，并据实验室具体情况稍做修改。取一健康成年人（无抽烟史）静脉血0.2ml，加至0.2ml淋巴细胞分离液上, 3 000rpm/min离心3min，吸出中间白色絮状的淋巴细胞层，用PBS溶液洗一次。将已分离好的淋巴细胞加入到1640培养液中，并加入适当染毒物质形成三个浓度梯度：4、12、20m3 air eq/mL，于37℃恒温摇床中（180r/min），避光情况下染毒2h。测试组分包括有机总提物组分（T00、P00）和芳烃组分（P02、T02）。阴性对照为5%DMSO（V/V），空白对照为样品空白滤膜的提取物。将上述染毒处理后的细胞，用PBS缓冲液洗涤2次，在PBS中将细跑浓度调为3 ×106/ml左右。用100μl 0.75％的正常熔点琼脂糖(NMA)铺第一层胶，4℃凝固10min。将25μl细胞悬液与75μl的0.75％低熔点凝胶(LMA)充分混匀，铺第二层胶，4℃凝固10min。接下来将处理好的玻片放入预冷的裂解液中(pH=10、2.5mol/L NaCl、100mmol/L EDTA-Na2、10mmol/L Tris base)，临用前加入1％TritonX-100和10％DMSO。4℃条件下裂解90min。电泳前先将裂解好的玻片在电泳液(pH=13，1mmol/L EDTA2Na2和300mmol/L NaOH)中4℃条件下解旋20min。然后将玻片平铺在水平电泳槽中，使电泳液刚刚没过玻片，在20V、200mA条件下电泳20min。经过15min中和处理后(pH=7.5，0.4mol/L Tris-HCl)，用2μg/ml溴化乙啶（EB）染色。玻片编为盲号，在荧光显微镜下（绿色激发光）观察，每片随机观察50个细胞。所得各组彗星图像采用CASP软件处理，得到Tail Length、Tail DNA%和Olive Tail Moment（OTM）三个参数数据［5］。
1.4 微核试验 微核试验方法参见文献［6］。取肝素抗凝静脉血(来自一健康男性，无抽烟史)0.3ml，加入到4.5ml含20%小牛血清的1640培养液中，并加入PHA，置于37℃，5% CO2的培养箱中。经过24h的PHA的刺激增长后在培养液中加入一定量的T00，P00，T02，P02，所得溶液最终染毒浓度为 4、12、20m3 air eq/ml。阳性对照为 30μg/ml环磷酰胺（Cyclophosphamide，CP)，阴性对照为(0.05％，v/v) DMSO染毒，继续培养至44小时后，加入Cty-B（终浓度为6μg/ml），再继续培养28h后收获细胞，进行低渗、固定、涂片和染色处理。400倍镜下观察，微核的识别和鉴定标准严格按照Fenech, M.等人的描述，每例分析1000个双核淋巴细胞，计算双核淋巴细胞中的微核率［6］。
1.5 数据分析 用SPSS13.0 for windows 进行统计分析。符合方差分析条件的试验组则进行组间的两两检验或多组比较，不符合条件的则采用非参数方法进行分析［4］。
2 结果
2.1 有机提取物对淋巴细胞DNA的损伤 在彗星试验中，经过2h的染毒，颗粒物有机提取物在不同浓度水平下均导致了显著的DNA损伤。与阴性对照相比较，4m3 air eq/ml、12m3 air eq/ml、20m3 air eq/ml各浓度组分的DNA损伤差异均有统计学意义（P<0.001）。而在同一浓度水平下，总有机抽提物和芳烃组份引起的DNA损伤差异无统计学意义（P>0.05）。浓度0m3 air eq/ml为样品空白膜的提取物。由于样品空白膜提取物和阴性对照对 DNA损伤的影响一致，所以以下关于处理组的显著性差异是与阴性对照相比较的结果。在设定浓度范围内，DNA损伤水平与粗提物和芳烃组分间存在有较好的剂量—效应关系，随着染毒浓度的增大，损伤越来越显著，具体结果详见图1。其他研究也有类似的结果，如 Antwerp市中心的PM10有机提取物，经24h暴露后，彗星试验结果显示在10、20m3 air eq/ml浓度处理组与空白组比较显示出显著性差异(P<0.05)［7］。用丙酮或甲苯提取的罗马PM10中有机物与空白处理组相比，在3m3 air eq/mL时即有显著性差异［8］。
另对所选用的三个参数间进行相关性分析得出较高的相关性（相关系数在0.95以上），这与 Vaipayee et al. 的结果一致［9］。Collins et al［10］认为 Tail DNA％比Tail Length和Tail Moment 这两个指标更有代表意义，认为它是一个独立的指标，当不同类型细胞或不同条件下比较时更有用。本文的试验结果表明 OTM 指标较 Tail DNA％更有优势，因为OTM不仅与Tail DNA%有着密切关系，而且还综合考虑了尾部和头部重心间的距离也即DNA密度。因此可用Olive Tail Moment 作为彗星试验结果指标。
图1 广州市TSP和PM10有机提取物浓度与DNA损伤间的剂量—效应关系（略）
暴露剂量以m3 air eq/ml表示，效应以OTM表示。
2.2 微核试验 结合彗星试验结果，我们对 PM10 和 TSP 分别进行T00, P00和T02, P02的微核试验，每个组分设定三个浓度梯度，且培养基中含有不超过0.3%(v/v)的DMSO。阴性对照结果与空白对照结果相近。对结果进行多个相关样本的非参数检验（K Related Sample Test）显示，只有12m3 air eq/ml 水平的T00处理组和20m3 air eq/ml水平的P00处理组，微核率与阴性对照有显著性差异(P<0.05)。其他组分和浓度均无引起显著微核率，且没有明显剂量—效应关系。在比利时佛兰德斯市的 PM10有机提取物的 CBMN研究中得到有剂量—效应关系，并且在10、20m3 air eq/ml浓度处理组，微核率与空白对照结果相比呈显著性差异(P<0.05)［7］。这可能与细胞敏感性和微核检测标准间的差别有关。
3 讨论
在本次试验中，比较彗星试验和微核试验结果，发现彗星试验中T02 的20m3 air eq/ml处理组导致了显著的DNA损伤，而该浓度下染毒组只出现相对较低的微核数。并且在微核试验中并未发现染毒浓度和微核间有剂量—效应关系。因此，微核试验在检测广州市颗粒物有机提取物的遗传毒性中没有彗星试验这种方法敏感。而Flanders 市区PM10有机提取物浓度与微核间存在线性关系，但彗星试验中未呈现有剂量—效应关系，且不加S9时，微核试验较彗星试验敏感［7］。董力等将颗粒物有机提取物进行微核试验得出微核率显著增高且有剂量效应关系［11］。因为不同的试验方法有着不同的作用机制，有研究证明彗星试验在检测由直接致突变物质引起的DNA 损伤要比大部分间接致突变物质引起的损伤敏感，这可能与致突变物质的作用类型不同有关［12］。这跟颗粒物中主要所含直接致突变物质的多少有关，另有不同溶剂提取颗粒物得到的有机物质组成会有较大的差异。本次试验验证了在检测环境污染物的遗传毒性中，彗星试验有较其他遗传毒性试验的优势，由于彗星试验可以监测到单细胞中很短链的DNA损伤，如单链断裂，双键断裂和碱性位点损伤［13］，所以已广泛应用在DNA链断裂的遗传毒性检测中。
【参考文献】
［1］ 魏复盛.空气污染对呼吸健康影响研究［M］.北京:中国环境科学出版社,
［2］ Fenech M, Holland N, Chang WP, et al. The human micronucleus project -An international collaborative study on the use of the micronucleus technique for measuring DNA damage in humans［J］.Mutat Res,1999, 428: 271～283.
［3］ Collins AR, The Comet Assay for DNA Damage and Repair: Principles, Applications, and Limitations［J］. Mol Biotechnol, 2004,26:249～261.
［4］ Haijuan X, Xinming W, Ulrich P, et al. Genotoxicity of total and fractionated extractable organic matters in fine particles from urban Guangzhou: a comparison between haze and non-haze episode days［J］. Environ Toxicol Chem, 2008, 27(1):206～212.
［5］ Konca K, Lankoff A, Banasik A, et al. A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay［J］. Mutat Res, 2003, 534(1-2):15～20.
［6］ Fenech M. The in vitro micronucleus technique［J］. Mutat Res, 2000, 455(1-2): 81～95.
［7］ Brits E, Schoeters G, Verschaeve L. Genotoxicity of PM10 and extracted organics collected in an industrial, urban and rural area in Flanders, Belgium［J］. Envi Res, 2004,96(2):109～118.
［8］ Buschini A, Cassoni F, Anceschi, E., et al. Urban airborne particulate: genotoxicity evaluation of different size fractions by mutagenesis tests on microorganisms and comet assay［J］. Chemosphere, 2001, 44(8):1723～1736.
［9］ Vaipayee P, Dhawan A, Shanker R, Evaluation of the alkaline comet assay conducted with the wetlands plant Bacopa monnieriLas a model for ecogenotoxicity assessment［J］. Environ Mol Mutagen, 2006, 47:483～489.
［10］ Collins AR, Dusinska M, Gedik CM, et al. Oxidative damage to DNA: do we have a reliable biomarker?［J］. Environ Health Perspect, 1996, 104 Suppl 3:465～469.
［11］ 董力，杨文敏.大气颗粒物不同有机组分对人淋巴细胞遗传毒性的影响［J］.职业与健康，2005,21(8):1218～1219.
［12］ Hartmann A, Schumacher M, Plappert-Helbig, U, et al. Use of the alkaline in vivo comet assay for mechanistic genotoxicity investigations［J］. Mutagenesis, 2004, 19:51～59.
［13］ Topinka J,Schwarz, LR, Wiebel FJ, et al. Genotoxicity of urban air pollutants in the Czech Republic. Part II. DNA adducts formation in mammalian cells by extractable organic matter［J］. Mutat Res, 2000,469: 83～93.
作者单位：广东省职业病防治院，广东 广州 510310； 中国科学院广州地球化学研究所，广东 广州 510640