肥胖男性β3肾上腺素能受体基因多态性研究

【摘要】  目的 研究单纯性肥胖男性β3肾上腺素能受体（β3-adrenergic receptor, β3-AR）Trp64Arg多态性的分布情况及对肥胖类型的影响。 方法 利用聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性（PCR-RFLP）方法检测单纯性肥胖患者及正常对照β3-AR 基因Trp64Arg突变。进一步比较不同类型肥胖中突变的发生率。 结果 β3-AR 基因Trp64Arg突变频率在正常对照组、周围性肥胖组及中心性肥胖患者中分别为16.67％、21.05％、34.78％，Arg等位基因在3组中的频率依次为8.33％、10.53％、19.57％。中心性肥胖患者Trp64Arg突变及Arg等位基因频率较正常对照及周围性肥胖者明显增加，但无统计学差异。 结论 β3-AR基因Trp64Arg 突变可能与男性单纯肥胖者腹内脂肪积聚有关，对此需进一步扩大样本后加以研究。

【关键词】  肥胖 肾上腺素能受体 多态性

β3肾上腺素能受体（β3-adrenergic receptor, β3-AR）基因定位于8p11.1-p12，是由402个氨基酸组成的蛋白多肽，是一种G蛋白偶联的膜表面受体，主要分布在腹腔内脂肪组织，参与调节腹腔内脂肪组织的脂解及产热过程。β3-AR基因序列的第190位上的T→C突变，导致氨基酸多肽序列64位上的色氨酸（TGG）被精氨酸（CGG）取代（Trp64Arg），由于这一突变正好位于受体的第一个细胞内功能区，可致机体内脂肪分解下降，生热作用减弱，从而可能成为肥胖、2型糖尿病等的病因之一。已有的研究发现β3-AR基因Trp64Arg多态性与糖尿病、胰岛素抵抗、肥胖可能有一定关联［1～6］，但不同人群中，该基因突变表达受环境、性别等因素的影响，其突变率存在种族差异。本文研究深圳地区单纯性肥胖男性β3-AR Trp64Arg多态性的分布情况及对肥胖类型的影响。

　　1  材料与方法

　　1.1  样本  60例男性研究对象选自深圳市健康体检人群，经体检排除高血压、糖尿病等心血管疾病和代谢性疾病。按照国际标准，受试者以体重指数（BMI）<25kg/m2为正常对照，BMI≥25kg/m2为超重加肥胖组，其中超重和肥胖组按腰臀比再分为周围性肥胖组（腰臀比<0.90）和中心性肥胖组（腰臀比≥0.90）。正常对照组18例，平均年龄(31.6±6.7)岁；周围性肥胖19例，平均年龄(33.6±5.0)岁；中心性肥胖23例，平均年龄(37.5±8.6)岁。

　　1.2  β3-AR 基因Trp64Arg多态性检测

　　1.2.1  DNA提取  取抗凝外周静脉血200μl，用QIAamp DNA Blood Mini Kit（QIAGEN）试剂盒提取基因组DNA，最后用200μl洗脱液洗脱DNA，取2μl作为PCR扩增模板。

　　1.2.2  β3-AR基因PCR扩增  PCR扩增采用的引物序列参考文献［5］，序列为上游引物：5’-CGCCCAATACCGCCAACAC-3’，下游引物：5’-CCACCAGGAGTCCCATCACC-3’，由上海生工生物技术服务公司合成。PCR反应体系25μl，包括引物各0.5μmol/L，2.5μl 10×PCR缓冲液，MgCl2浓度为2mmol/L，dNTPs各200μmol/L，Taq酶1 U。扩增条件为94℃预变性5min；94℃变性1min，61℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸5min。

　　1.2.3  RFLP分析  取上述PCR扩增产物5μl，用限制性内切酶MVaI 10U在37℃酶切2h（PCR试剂及MVaI酶均为FBI Fermentas公司产品）。MVaI酶切产物用12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB染色，紫外灯下拍照并判断结果。

　　1.3  统计分析  采用SPSS 11.0统计软件进行统计分析，基因型及等位基因频率采用直接计数法，组间差异采用t检验和方差分析，计数资料比较采用χ2检验。

　　2  结果

　　2.1  β3-AR 基因Trp64Arg多态性判定  β3-AR 基因PCR扩增产物大小为210bp。用限制性内切酶MVaI切割后，Trp64Trp正常纯合子有99、62、（30、12、7）bp条带，Trp64Arg突变杂合子有161、99、62、（30、12、7）bp条带，Arg64Arg突变纯合子有161、（30、12、7）bp条带，其中30、12、7 bp条带因长度较短，电泳后不易分辨（图1）。

　　图1  β3-AR 基因Trp64Arg多态性电泳图（略）

　　Fig 1  Identification of 3 polymorphisms of β3-adrenergic receptor

　　1. DNA marker（pBR322 DNA BsuRI (HaeIII) Marker, 5, Fermentas）; 2. Arg64Arg; 3. 4. 5. Trp64Arg; 6. 7. Trp64Trp）

　　2.2  等位基因的频率分布  由于检测到的Arg64Arg突变纯合子较少，将Arg64Arg合并到Trp64Arg突变杂合子中计算。正常对照组及单纯肥胖组（包括周围性肥胖及中心性肥胖）的Trp64Arg突变频率分别为16.67％、28.57％，差异不显著（P>0.05）。按体脂分布类型分组后，周围性肥胖组Trp64Arg突变频率为21.05％，中心性肥胖组Trp64Arg突变频率为34.78％（包括7例Trp64Arg及1例Arg64Arg突变），虽然中心性肥胖组相对正常对照及周围性肥胖组具有较高的突变频率，但差异不显著（P>0.05）。见表1。

　　表1  β3-AR基因Trp64Arg突变在各组中的分布（略）

　　Tab 1  Allelic frequency of the Trp64Arg mutation in different groups

　　3  讨论
   
　　β3-AR是一种G蛋白偶联的膜表面受体，通过G蛋白激活腺苷酸环化酶，使细胞内cAMP增多，再通过cAMP依赖性蛋白激酶使酶以及其他功能蛋白磷酸化，将细胞外信息变成细胞内效应，从而引发脂肪分解和产热。基于对膜受体结构与功能的研究结果，目前普遍认为β3-AR基因突变是肥胖、2 型糖尿病及胰岛素抵抗的一个促发因素，但对不同种族及人群的研究也有不同的结果。
   
　　β3-AR基因作为肥胖候选基因，涉及肥胖相关表型，然而Arg64等位基因与体重的联系高度依赖于性别、年龄和其他的环境和遗传因素。McFarlane-Anderson等人的研究显示Trp64Arg突变在妇女中更多见，女性有此突变者更易发生肥胖，突变杂合子女性的BMI 增高，且与肥胖提前发生有一定联系［1］。对中国人群β3-AR基因突变的研究也显示，该基因突变对中老年女性体重调节的作用更明显［2］。而Arashiro等用PCR-RFLP方法测定了105例日本肥胖儿童的基因变异，结果显示携带Trp64Arg突变基因的肥胖男孩BMI较高而血HDL apoA I和apoAⅡ水平较低，但在肥胖女孩中没有显著差异［3］。
   
　　近年来在对肥胖的分子病因学研究中发现，β3-AR基因Trp64Arg突变与中心性肥胖相关。Sakane等认为β3-AR基因Trp64Arg突变是中心性肥胖和代谢综合征的遗传标志［4］，国内也有报道中心性肥胖者β3-AR基因突变有明显升高趋势［5］，但在不同种族也有不同的报道［6］，提示可能存在种族差异。本文研究结果表明，中心性肥胖者β3-AR基因突变较周围性肥胖和正常对照均有明显升高趋势，但没有统计学差异。有可能是样本量偏小对结果造成的影响，此外基因突变的具体类型(如纯合或杂合) 差异所引起的受体功能不一，也可能对肥胖表型产生不同的影响，因此需进一步扩大样本后加以研究证实。

【参考文献】
  　　［1］ McFarlane-Anderson N, Bennett F, Wilks R, et al. The Trp64Arg mutation of the beta3-adrenergic receptor is associated with hyperglycemia and current body mass index in Jamaican women［J］. Metabolism, 1998, 47(5):617～621.

　　［2］ 孙黎明, Iizuka Y, Ishibashi S, 等. 中国人与日本人β3肾上腺素能受体基因Trp64Arg 突变的比较［J］. 中华医学杂志, 2000, 80(2):107～110.

　　［3］ Arashiro R, Katsuren K, Fukuyama S, et al. Effect of Trp64Arg mutation of the beta3-adrenergic receptor gene and C161T substitution of the peroxisome proliferator activated receptor gamma gene on obesity in Japanese children［J］.Pediatr Int, 2003, 45(2):135～141.

　　［4］ Sakane N, Yoshida T, Umekawa T, et al. Beta 3-adrenergic-receptor polymorphism: a genetic marker for visceral fat obesity and the insulin resistance syndrome［J］. Diabetologia, 1997, 40(2):200～204.

　　［5］ 朱旅云，刘坤申. β3肾上腺素能受体基因Trp64Arg 突变与单纯肥胖者早期动脉粥样硬化的相关研究［J］.河北医科大学学报，2004，25(1):4～7.

　　［6］ Rissanen J, Kuopusjrvi J, Pihlajamki J, et al. The Trp64Arg polymorphism of the beta 3-Adrenergic receptor gene. Lack of association with NIDDM and features of insulin resistance syndrome［J］. Diabetes Care, 1997, 20(8):1319～1323.

作者单位：深圳市人民医院中心实验室，广东 深圳 518020