β 3 肾上腺能受体基因Trp64Arg多态性与心力衰竭的相关性研究

     【摘要】 目的  探讨β 3 肾上腺能受体（β 3 -adrenergic receptor，以下简称β 3 -AR）基因Trp64Arg多态性与心力衰竭（heart failure，以下简称HF）的相关性。 方法  应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技术分析62例HF患者和60例正常受试者的β 3 —基因Trp64Arg多态性。 结果  HF患者Arg等位基因频率（0.25）高于对照组（0.17），P<0.05。 结论  在中国汉族人群中，β 3 -AR基因Trp64Arg多态性与HF有明显相关性，Arg等位基因可能是一个HF的易感基因。

    关键词  心力衰竭 β 3 肾上腺能受体 基因多态性

    Study of relationship betweenβ3 -adrenoceptor gene Trp64Arg polymorphism and heart failure

    Han Lihua，Niu Yonghong

    The People's Hospital of Changzhi City，Shanxi046000.
   
    【Abstract】 Objective Studying the relationship between the Trp64Arg polymorphism ofβ 3 -adrenoceptor（β 3 -AR）gene and heart failure（HF）.Methods Theβ 3 -AR genotype was determined in62HF patients and60nor-mal controls by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）.Results Arg allele frequency ofβ 3 -AR gene of HF group was higher than that of control（0.25vs0.17，P<0.05.Conclusion The Trp64Arg polymorphism ofβ 3 -AR gene and HF were significant correlation in Chinese population.Arg allele ofβ 3 -AR gene may be one of the genes in correlation with HF in Chinese patients.

    Key words heart failure β 3 -adrenoceptor gene polymorphism

    HF是一组由不同病因引起的临床症候群，其本质可能是心肌细胞基因异常表达的结果 ［1］ 。β 3 -AR于1989年被克隆 ［2］ ，主要分布于白色和棕色脂肪组织，参与产热和脂溶效应。新近发现β 3 -AR兴奋可使心脏产生负性变收缩力效应，HF时β 3 -AR含量明显增加，这种作用增加更明显 ［3］ 。人类β 3 -AR存在Trp64Arg多态性，表现为第387位碱基由T替换为C，从而导致编码该蛋白质的第64位的色氨酸（Trp）替换为精氨酸（Arg）。本文研究该基因多态性与HF的关系。

    1 对象与方法

    1.1 对象 （1）HF组:62例HF患者均为住院病人。男32例，女30例，均为汉族，年龄（57.5±5.6）岁，心功能分级按纽约心脏学会（NYHA）1994年修订的标准进行评价，心功能Ⅲ级35例、Ⅳ级27例。（2）正常对照组:60例正常人，来自健康体检者，男30例，女30例，均为汉族，年龄（56.4±6.6）岁，体检心电图、血压、血糖、血脂及肝肾功能均正常。

    1.2 方法

    1.2.1 测定部分临床指标 测定空腹血糖（FG）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDLc）和低密度脂蛋白（LDLc）浓度。

    1.2.2 基因组DNA的提取 取外周EDTA抗凝的静脉血5ml，进行白细胞分离、破膜后，蛋白酶K（德国Merck公司）消化，饱和盐析法提取DNA，TE保存。

    1.2.3 目的片段扩增 所用引物序列为:引物1:5′-CAATAC CGC CAA CAC CAG TGG G-3′，引物2:5′-GGT CAT GGT CTG GAG TCT CG-3′。PCR反应总体积30μl，其中DNA模板约100ng，dNTPs0.15mmol/L，上下游引物各25pmol，10×buffer（不含Mgcl 2 ）3μl，MgCl 2 15mmol/L，Taq DNA聚合酶0.5U。应用PE-2400扩增仪（美国PE公司）进行扩增反应。PCR反应设置为95℃预变性10min后，进入循环:95℃30s、60℃30s、72℃30s，共进行30个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下检测。

    1.2.4 基因型的检测 取6μl PCR产物，限制性内切酶MvaI（大连宝生物公司）6U，10×缓冲液1.5μl，灭菌的去离子双蒸水6.9μl，反应总体积15μl。在37℃酶切1h。产物用3%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下检测。Marker采用100bp的DNA ladder（大连宝生物公司）。

    1.3 统计学方法 所有数据均以均数±标准差表示。组间等位基因型及等位基因频率比较用χ 2 检验。组间均数比校采用单因素方差分析。Hardy—Weinberg平衡用χ 2 检验。P<0.05认为有统计学意义。

    2 结果

    2.1 HF组与对照组临床指标 见表1。两组间性别构成、年龄、空腹FG、TC、TG、HDLc和LDLc差异均无显著性。

    2.2 HF组和对照组β 3 —AR基因Trp64Arg多态性比较 PCR扩增产物为210bp的DNA片段，若扩增片段中存在T387C碱基替换，则含MvaI内切酶切点（CC▲A/TGG），经MvaI内切酶消化后产生6bp、15bp、31bp、61bp和97bp共5个片段，因此Trp/Trp基因型有5个片段（6bp、15bp、31bp、61bp和97bp），Trp/Arp基因型有6个片段（6bp、15bp、31bp、61bp、97bp和158bp），Arg/Arg基因型有4个片段（6bp、15bp、31bp和158bp）（图1）。

    表1 HF组与正常对照组临床指标比较 （略）
   
    M泳道为标志物（DNA Marker DL2000，由上至下分别为:2000、1000、750、500、250、100bp）Ⅰ泳道为PCR扩增产物210bp;Ⅱ泳道为Arg/Arg纯合子158bp;Ⅲ泳道Trg/Arg杂合子158bp、97bp、61bp;Ⅳ泳道为Trg/Trg纯合子97bp、61bp

    图1 β 3 受体Trp64Arg基因型

    2.3 HF组与正常组Trp64Arg等位基因频率比较 62例HF患者Arg等位基因频率为0.25，60例正常对照组Arg等位基因频率为0.17。经χ 2 检验，HF组Arg等位基因频率高于对照组，P<0.05（表2）。这两组的Trp/Arg多态性分布均符合Hardy-Weinberg定律。

    表2 HF组与对照组的β 3 受体基因Trp64Arg基因型和等位基因频率分布（略）注:与正常组比较χ 2 =4.14， * P<0.05

    3 讨论

    HF是许多心血管疾病的终末转归，是由于心肌收缩和 （或）舒张功能障碍使心泵功能降低，导致心输出量减少，不能满足机体组织代谢需要的一种病理过程。尽管不同病病导致的HF的发病机制不完全相同，但仍有一些共同之处，其中交感—肾上腺素系统在各种病因导致的HF的发生发展过程中均发挥了重要作用。研究表明在衰竭心脏中，β 1、2 -AR下调或脱敏，而β 3 -AR却代偿性上调，这可被看作是一种防止心肌细胞进一步损害的机制，除了直接影响变收缩力效应外，β 3 -AR对血管张力的调节有助于降低周围血管阻力及衰竭心脏的后负荷，如果其在微循环也发挥作用，还可防止缺血。另外在心肌内，伴随着β 3 -AR兴奋，NO释放可增强舒张期松弛，从而可增加衰竭心脏的舒张期限贮备，减少耗氧量 ［4］ 。但当心衰发展到晚期，这种代偿机制由于持续的负性变收缩力效应而进一步抑制心肌即变成失代偿，在循环儿茶酚胺增加时这种作用更明显。Stephane等 ［5］ 通过研究人类正常和衰竭心脏的β 3 -AR表达和收缩效应，发现衰竭心脏比正常心脏高2～3倍、与β 3 -AR耦联产生负性肌力的Gi-2蛋白也增高;而选择性β 3 -AR激动剂的负性肌力作用降低幅度却很小。β-AR拮抗剂可明显改善HF症状和提高生存率，这一点已得到公认。但临床上发现联合应用β 1、2 -AR拮抗剂治疗时，并非所有患者的HF症状均有改善，这是否由于该拮抗剂仅仅对β 1、2 -AR有选择性，而并未阻断β 3 -AR，却使其性能相应上调，从而使HF加重。该假设还有待进一步探讨。人类β 3 -AR存在Trp64Arg多态性，表现为第387位碱基由T替换为C，从而导致编码该蛋白质的第64位的色氨酸（Trp）替换为精氨酸（Arp）。本文通过研究该基因多态性与HF的关系发现HF患者Arg等位基因频率（0.25）高于对照组（0.17），P<0.05。在中国汉族人群中，β 3 -AR基因Trp64Arg多态性与HF有明显相关性，Arg等位基因可能是一个HF的易感基因，从而为HF的彻底根治提供一新思路。

    参考文献

    1 Lenfant C.Fixing the failure heart.Circulation，1997，95:771-772.2 Emorine LJ，Marullo S，Briend-Sutren MM，et al.Molecular character-ization of the human beta3-adrenergic receptor.Science.1989Sep8;245（4922）:1118-1121.

    3 Gauthier C，Tavernier G，Charpentier F，et al.Functional beta3-a-drenoceptor in the human heart.J Clin Invest，1996Jul15;98（2）:556 -562.

    4 Loke KE，Laycock SK，Mital S，et al.Nitric oxide modulates mitochon-drial respiration in failing human heart.Circulation.1999Sep21;100（12）:1291-1297.

    5 Stephane M，Lester K，Olivier F，et al.Upregulation of［beta］3-A-drenoceptors and Altered Contractile Response to Inotropic Amines in Human Failing Myocardium.Circulation，2001，103:1649-1655.

   

    作者单位:046000山西省长治市人民医院