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【摘要】 目的 了解白色念珠菌对常用抗真菌药物的耐药性及其耐药基因CDR1、CDR2的表达情况。 方法 常规方法分离123株临床菌株，科玛嘉念珠菌显色培养基作菌种鉴定，采用Rosco纸片扩散法进行药敏试验，所有耐药株与随机选择的同等数量的敏感株（对照株）用聚合酶链反应（PCR）扩增目标基因CDR1、CDR2，扩增产物经凝胶电泳后进行初步分析。 结果 123株白色念珠菌分布于呼吸道50.4％（62/123）、泌尿道28.5％（35/123）、生殖道14.6％（18/123）和其它6.5％（8/123）。通过药敏筛选，获得耐药菌株35株，其中有15株出现交叉耐药。受试菌对两性霉素、5-氟胞嘧啶、咪康唑、伊曲康唑和氟康唑的敏感率分别为99.2％、85.4％、87.0％、84.6％、和83.7％。35株耐药株和对照株均出现耐药基因CDR1、CDR2。 结论 白色念珠菌对常用抗真菌药物的敏感性呈下降趋势，编码外排蛋白的耐药基因CDR1和CDR2可能同时存在于全部受试菌株内。
【关键词】 白色念珠菌 耐药 CDR1 CDR2
近年，广谱抗生素和免疫抑制剂的广泛使用、年龄结构老龄化、有创性诊断和治疗技术的推广，导致条件致病性白色念珠菌感染的机会大幅增加。然而，随着抗真菌药的大量和长期应用，耐药菌株相继出现，已成为临床治疗的难题。为此，我们收集123株白色念珠菌，就其耐药情况和耐药基因CDR1、CDR2基因的表达情况进行初步研究，为临床治疗提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本来源 收集2007年5～7月广州医学院第一附属医院和广东省中医院临床分离的白色念珠菌123株。
1.1.2 质控菌株 质控菌株ATCC64548、ATCC45550购自卫生部药物鉴定所。
1.1.3 主要试剂 科玛嘉（CHROMagar）念珠菌显色培养基（郑州博赛生物科技有限公司），改良SHADOMY真菌药敏平板（江门凯林贸易有限公司），蛋白胨、葡萄糖、琼脂、酵母提取物Yeastextact（英国，OXOID公司），氯仿、异丙醇（江都市阳光节能化工有限公司），trizol试剂（凯基生物科技发展有限公司），基因扩增增引物、DNA Marker、RNA逆转录配套试剂、PCR配套试剂（北京赛百盛公司）。
1.1.4 主要仪器 Vitek-2全自动细菌鉴定仪（法国，Bio-Merieux公司），双向电泳仪（中国，北京六一仪器厂），UP紫外凝胶成像系统UP紫外透射仪（英国，UVP公司），PCR扩增仪（美国，BioRad PE公司）。
1.1.5 药敏纸片 两性霉素B 10μg/pic，氟胞嘧啶1μg/pic，咪康唑10μg/pic，伊曲康唑8μg/pic，氟康唑25μg/pic，均购自广州市迪景微生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 标本分离与鉴定 标本按常规接种于沙氏平板培养24h，取直径在0.5～1.5mm、光滑、凸起、湿润的小白菌落涂片镜检，如为念珠菌，取菌落接种在科玛嘉（CHROMagar）念珠菌显色平板上，35℃培养24h，观察结果。在显色培养基上生长为淡绿色菌落为白色念珠，同时用Vitek-2全自动细菌鉴定仪进行菌种鉴定。
1.2.2 药敏试验 将已鉴定的白色念珠菌、质控菌株ATCC64548和ATCC45550，分别用生理盐水配制成0.25麦氏比浊悬液，菌液均匀涂布于真菌药敏平板上。选用Rosco药敏纸片：两性霉素B(Amphotericin B，AMB)10μg/pic、5-氟胞嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)1μg/pic、咪康唑(Miconazole，MIC)10μg/pic、伊曲康唑(itraconazole，ITR)8μg/pic、氟康唑(fluconazole，FCA)25μg/pic，35℃孵育24h，量取药敏环直径。结果判断参考美国NCCLSM-27A的真菌药敏标准，药敏抑菌环符合以下情况者为敏感株：AMP>15mm、5-FU>20mm、MIC>20mm、ITR>16mm、FCA>22mm。药敏抑菌环只要符合下述标准中的其中一项则视为耐药：AMP<10、5-FU<11、MIC<12、ITR<9、FCA<14。
1.2.3 总RNA的抽提［1］和逆转录 所有耐药株与随机选择的同等数量的敏感株（对照株）接种于YPD固体培养基(酵母提取物Yeastextact 10g，琼脂、葡萄糖和蛋白胨各20g，10ml含50mg氯霉素的95%乙醇，加灭菌水至1 000ml配制而成)，35℃培养24h，再一次转种到YPD培养基，35℃培养24h以保证菌株的纯度。选取3～4个单个菌落加入已有1mlTrizol试剂的1.5mlEP管，吹打混匀，室温下静置5min，加入氯仿0.2ml，振荡器上振荡15s，静置3min，4℃ 12 000g离心5min，取全部上清并加入0.5ml异丙醇，静置10min，4℃ 12 000g离心10min，弃去上清，加入75％乙醇1ml，振荡1min，4℃ 7 500g离心5min，弃去上清，沉淀室温下干燥5～10min，复溶于40μl 1％DEPC水中。取上述溶液5μl，加入oligo(DT)18 1μl，混匀，70℃水浴5min后，放置于冰上，加入5XM-MLV buffer 4μl，dNTP 1μl，100mMDTT 2μl，RNasin 0.25μl，Reverse Transcripase0.5μl，DEPC水6.25μl，混匀，置42℃，1h，95℃，10min。
1.2.4 PCR扩增 使用CDR1,CDR2,TEF3(内参)引物3对［2］，分别为：
CDR1(UP) 5’-CCAACAATACAAGACCAGCAT-3’
CDR1(DOWN) 5’-ACCATAGCCAATAACAACACG-3’
CDR2(UP) 5’-GCAACTCACAACATCCAAGA-3’
CDR2(DOWN) 5’-GAGTCGTCTGGTTTCTTCAA-3’
TEF3(UP) 5’-AGAAACCGTCCACTTGTTG-3’
TEF3(DOWN) 5’-GTGCAAGAAAATGGTGGCAAAT-3’
反应体系［2］：PCR反应体系20μl，包括：10xTaq Buffer 2μl，MgCl2 1.6μl，dNTP 1μl，模板2μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，TaqDNA聚合酶，双蒸水12.2μl。扩增程序：预变性94℃ 2min，94℃ 30sec，50℃ 30sec，72℃ 30sec 30个循环，72℃延长10min。
1.2.5 扩增产物电泳 取PCR扩增产物4.5μl与0.5μl 10×buffer 混匀后，在1%琼脂糖凝胶（0.5xTBE缓冲液配制）中电泳20min（TAE缓冲液、100V），溴化乙锭染色，凝胶成像系统观察记录电泳结果。
2 结果
2.1 标本分布 所收集的123株白色念珠菌主要来源于呼吸道和泌尿系统，其中呼吸道标本62株（50.4％），尿液标本35株（28.5％），其次为白带标本18株（14.6％），而源于其他的标本仅8株（6.5％）。
2.2 药敏试验 药敏试验结果见表1。结果可见：白色念珠菌对两性霉素B的敏感率最好，其余各种药物都出现不同程度的耐药。同时出现交叉耐药的情况：5-FU耐药的菌株中有2株耐MIC，1株耐ITR；在ITR耐药株中，有2株出现MIC耐药，7株出现FCA耐药；在FCA耐药株中，有1株MIC耐药，还有1株对3种唑类药物出现耐药。
表1 123株白色念珠菌对常用药物的耐药情况（略）
2.3 PCR扩增结果 35株耐药菌株和35株对照菌株，PCR扩增CDR1、CDR和TEF3（内参）基因，结果发现70株白色念珠菌均出现上述3个基因片断。在517bp、566bp和380bp各处出现一明亮的条带，与TEF3、CDR1和CDR2的扩增片断大小相吻合。
图1 CDR1、DR2电泳结果（略）
1：DNA Marker；2-3：耐药株CDR1阳性；4：敏感株CDR1阳性；5-6：耐药株CDR2阳性；7：敏感株CDR2 阳性；8：TEF3内参。
3 讨论
白色念珠菌是临床上最常见的致病酵母菌，近年来，由于艾滋病的流行，广谱抗生素的滥用，化疗、放疗、免疫抑制剂的应用，年龄结构老年化，以及有创性诊断和治疗的推广，白色念珠菌的机会性感染率显著上升，由此感染而引起的多器官功能衰竭以及死亡的产生日益增加。本试验123株白色念珠菌的临床标本分布发现，白色念珠菌感染主要侵袭呼吸道，其次为泌尿道和生殖道。值得注意的是呼吸系统的感染占主要地位，这可能与本院呼吸道感染患者较多，且多数患者病情重并较长时间使用抗生素密切相关。
20世纪80年代以来，先后推出了酮康唑(KTC)、氟康唑(FCA)、咪康唑(MIC)、伊曲康唑(ITR)等抗真菌药物，并在临床上得到广泛应用，随之白色念珠菌对唑类药物出现耐药性，1978年，Holt等［3］首次报道念珠菌尿路感染的患儿在连续服用9周咪康唑后，对该药产生耐药，GrayBill［4］发现伴发念珠菌血症的HIV患者抗真菌治疗失败率达20%～30％，这与念珠菌的高耐药性相关。国内田防震等［5］报道白色念珠菌耐药率分别为AMB(9.3%)、ITR(9.7%)、FCA(10.5%)。周小明［6］等则报告白色念珠菌对FCA的耐药率高达46.8%，ITR、AMB分别为7.2%和3.6%，而沈萍［7］等认为白色念珠菌对5-FU、AMB、ITR和FCA均具有极高的敏感率(96.7%～99.7%)，耐药率最高的ITR仅为1.2%，其余3种抗真菌药耐药率均为0.3%。国内对白色念珠菌耐药情况的结果差异较大。本试验结果显示，白色念珠菌对常用抗真菌药的敏感率分别为99.2％（AMB）、85.4％(5-FU)、87.0％(MIC)、84.6％(ITR)和83.7％(FCA)，结果与喻华［8］报道（ITR：82.26％、FCA：81.94％）相近，但与报道［2,4］有较大差异，与广州地区的报道［9］相比，除了对AMB的敏感率（98.9％）接近外，对5-FU（94.9％）、ITR（67.0％）、FCA（91.2%）的敏感率也有较大差异，提示白色念珠菌耐药性可能与各个医院之间菌株来源和用药压力不同而导致的差异密切相关。本试验结果还显示白色念珠菌对两性霉素B、氟胞嘧啶、咪康唑、伊曲康唑、氟康唑中度敏感率分别为0.8％、2.4％、8.9％、1.6％和7.3％，提示中度敏感菌株增多，而中度敏感菌株增多，提示白色念珠菌对唑类药物敏感率下降。
伴随着临床深部真菌感染率的上升，临床使用抗真菌药物的频率、剂量明显增加，白色念珠菌出现了交叉耐药情况，Magaldi等［10］发现HIV患者44.7％的菌株对氟康唑产生耐药，在这些耐氟康唑的菌株当中，又有93.3％对伊曲康唑交叉耐药。本试验123株白色念珠菌有35株耐药菌株，其中有15株出现交叉耐药，特别是有1株白色念珠菌同时对3种唑类药物出现耐药。提示白色念珠菌耐药现象将越来越严重，交叉耐药菌株的出现将给临床治疗带来棘手的问题。
药物作用靶点的基因突变或过度表达以及细胞对药物的主动外排以减少药物在细胞内的积聚，是真菌的主要耐药机制［11］，其中，药物外排能力的增强导致胞内药物浓度降低，可能是白色念珠菌最主要的耐药机制［12,13］。目前研究主要集中在外排基因CDR1的表达上，CDR1为白色念珠菌最早发现的外排基因，有研究显示［14］,白念珠菌CDR1 基因的高表达与氟康唑耐药有关,氟康唑耐药株CDR1 mRNA的表达水平比对应的敏感株要高出很多，而胞内药物的浓度则很低，Lyons等［15］的研究证实,mRNA水平的升高是由CDR1、CDR2和MDR基因转录增强所致。国内韩旭东等［16］报道氟康唑能诱导白色念珠菌外排基因CDR1高表达而引起耐药，但也有报道［17］认为并非所有耐唑类药物的白色念珠菌都出现CDR1的表达，White［18］发现耐药株和敏感株都出现CDR1的表达，结果差异提示有必要就CDR1的表达与白色念珠菌耐药的关系作进一步研究。CDR2是白色念珠菌另一外排基因，但目前CDR2报道少见。
本试验对35株耐药和敏感株（对照株）用PCR扩增目标基因CDR1、CDR2，结果发现耐药和敏感菌株均分别在517bp、566bp和380bp处出现一明亮的条带，与TEF3、CDR1和CDR2的质控片断大小相吻合。外排基因CDR1和CDR2均在耐药和敏感的白色念珠菌中表达，结果与文献［15］报道相一致，提示白色念珠菌无论是耐药还是敏感，都存在CDR1和CDR2外排基因的表达，都有可能出现对抗真菌药物的外排，但外排能力的产生并不代表白色念珠菌耐药现象的出现，CDR1或CDR2的表达量与耐药性的关系，有待进一步研究。
【参考文献】
［1］ 贺志彬，廖万清，熊爱君，等.白念珠菌CDR1 基因表达与氟康唑耐药的关系［J］.上海医学杂志,2004,27(2):126～128.
［2］ 郭慧君，夏忠弟，吴高莉，等.耐药白念珠菌主动外排泵蛋白的功能与基因表达［J］.中南大学学报,2007,32(1):183～187.
［3］ Holt RJ, Azmi A. The emergence of Candida albicans resistant to miconazole during the treatment of urinary tract candidosis［J］. Infection,1978,6(4):198～199.
［4］ Graybill JR. Changing strategies for treatment of systemic mycoses［J］. Braz J Infect Dis,2000,4(2):47～45.
［5］ 田防震,郭长青,王开军. 临床常见念珠菌药敏实验研究［J］.中国麻风皮肤病杂志,2005,21(6):458～459.
［6］ 周小明, 严子禾, 胡锡地. 147 株住院患者呼吸道念珠菌感染的鉴定及耐药性分析［J］.中国抗生素杂志,2006,31(1):65～66.
［7］ 沈萍，张之烽.白色念珠菌对4种抗真菌药物的敏感性分析［J］.临床输血与检验,2007,9(2):158～159.
［8］ 喻华，黄湘宁，刘华，等.临床酵母样真菌的感染特点及耐药性研究［J］.中国微生态学杂志，2006,418(2):120～123.
［9］ 邱芳华,崔颖鹏,陈求刚. 651株深部真菌感染菌种分布及耐药性分析［J］. 中国微生物学杂志，2007,19(2):211～212.
［10］ Magaldi S，Mata S，Hartung C，et al. In vitro susceptibility of 137 Candida sp. Isolates from positive patients to several antifungal drugs［J］. Mycopathologia,2001,149(2):63～68.
［11］ 温汪荣，戴庚孙.念珠菌耐药性的研究进展［J］. 国外医学临床生物化学与检验学分册，2001，22(1):38～39.
［12］ Wada S，Niimi M，Niimi K，et al. Candida glabrata ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Pdh1p expressed in a Saccharomyces cerevisiae strai deficient in membrane transporters show phorylation dependent pumping properties［J］. J Biolcham,2002,277(48):46809～46821.
［13］ Kontoyiannis DP，Lewis RE. Antifungal drug resistance of pathogenic fungi［J］. Lancet，2002,359(9312):1135～1144.
［14］ White TC, Holleman S, Dy F, et al. Resistance mechanisms in clinical isolates of Candida albicans［J］. Antimicrob Agents Chemother,2002,46(6):1704～1713.
［15］ Lyons CN, White TC. Transcriptional analyses of antifungal drug resistance in Candida albicans［J］. Antimicrob Agents Chemother, 2000,44(9):2296～2303.
［16］ 韩旭东，张永信.主动外排系统与白念珠菌耐药关系研究［J］.中华传染病杂志,2004,22(4):229～233.
［17］ Sanglard D, Ischer F，Monod M, et al. Susceptibilities of Calbicans multidrug transporter mutants to various antifungal agents and other metabolic inhibitors,Antimicrob［J］. Agents Chemother Oct,1996,40(10):2300～2305.
［18］ White TC. Increased mRNA levels of ERG16,CDR,and MDR1 correlate with increases in azole resistance in Candida albicans isolates from a patient infected with human immunodenficiency virus［J］.Antimicrob Agents Chemother,1997,41(7):1482～1487.
作者单位：广州医学院第一附属医院检验科,广东 广州 510120; 广州医学院检验系学生，广东 广州 510120