金黄色葡萄球菌肠毒素及其检测方法的研究进展

【关键词】  金黄色葡萄球菌 肠毒素 检测

　金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种人畜共患病的重要致病菌，该菌在自然界广泛存在于空气、水、尘埃及人和动物的排泄物中。金黄色葡萄球菌能产生多种致病性物质，如毒素、酶类和菌体的一些成份，该菌产生的主要毒素有：肠毒素（Staphylococcal enterotoxins，SE）、葡萄球菌溶素、表皮剥脱毒素、杀白细胞素、毒性休克综合征毒素—1等；产生的主要酶类有：凝固酶、耐热核酸酶、葡激酶等，其中SE在该菌的致病性中起着重要的作用。在美国由SE引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多占45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多见，中毒食品多为奶、肉、鱼、蛋及其制品以及剩饭，剩菜和凉盆；人畜化脓性感染部位常成为传染源。据报道［1］，每100g食物中含18μg SE时即能引起金黄色葡萄球菌食物中毒。因此，研究SE尤其是开展SE的检测和分型工作，对于由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒临床诊断和预防该菌引起的食物中毒均有重要意义。目前，检测SE主要用免疫琼脂扩散法、反向间接血凝法、免疫荧光法和酶联免疫吸咐法等，随着对SE研究工作的不断深入，一些快速和采用现代技术的检测SE方法不断出现，并且由于检测技术的提高促使SE研究水平的进步，本文就SE及其检测方法研究进展作一综述。

　　1  SE的生物学性状

　　1.1  性质  金黄色葡萄球菌肠毒素是金黄色葡萄球菌分泌的一组具有超抗原活性的细菌毒素，易溶于水和盐溶液，分子量为26～30KDa，对热稳定，可耐受100℃煮沸30min不被破坏，仍有致病性，能抵抗胃肠液中蛋白酶的水解作用［2］。有强大的激活淋巴细胞的能力，可使淋巴细胞产生强烈的细胞毒性作用和高水平的细胞因子，如肿瘤坏死因子（TNF）-a等，对肿瘤细胞具有强大的杀伤作用。近来有人研究SE在治疗肿瘤中的作用，已有相关的临床药物出现［3］。

　　1.2  分型  金黄色葡萄球菌能产生多种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，根据近年对食源性疾病的分析，其中20%～25%是由SE引起的［4］。依据SE抗原性和等电点的不同，目前发现SE有A、B、C、D、E、F、G、H、I和J等10个毒素血清型，以A和D型最常见，其中以A型的毒力最强，摄入1μg即能引起中毒，所以是引起食物中毒最多的，而C型又可分为C1、C2和C3三个亚型，所有的SE都是由单个无分支的多肽链所组成，易溶于水和盐溶液。一株金黄色葡萄球菌能产生一型或两型以上的肠毒素；但是，在产混合型毒素菌株中又常以某一型的肠毒素为主，因此，肠毒素的型别不能代表细菌的型别。

　　1.3  SE与酶的关系  葡萄球菌的致病力取决于它所产生的毒素和酶的能力，致病性菌株可产生肠毒素、溶血毒素、杀白细胞素、血浆凝固酶、耐热DNA酶等。其中肠毒素、血浆凝固酶和耐热DNA酶有密切关系，能产生肠毒素的葡萄球菌在厌氧条件下发酵葡萄糖，可产生耐热的核酸内切酶。目前不少研究者在研究金黄色葡萄球菌的耐药性课题，该菌的耐药性也与肠毒素的产生有关联，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）近100%产生肠毒素；而对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（MSSA）仅约有30%产生肠毒素。

　　2  SE的临床意义

　　2.1  食物中毒  金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒是一个全球性公共卫生问题，无论是过去还是现在，在发达的工业化国家和发展中国家，由SE引起的食物中毒都常有发生。据美国疾病预防控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒仅次于大肠埃希菌，居第二位，占细菌性食物中毒的33%，加拿大的发生率更高，占细菌性食物中毒的45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多，全国各地均有报告［5］，是疾病预防控制部门重点监测的疾病。一般情况下是患者进食了被金黄色葡萄球菌产生的肠毒素（一般认为约1μg/kg）刺激患者呕吐中枢而导致以呕吐为主要症状的食物中毒。所以，应将食品，尤其是含蛋白质多，水分多，淀粉多的熟食储存于4℃环境中，以防止微生物大量繁殖，继而产生大量的毒素，其中金黄色葡萄球菌肠毒素是主要的毒素［6］。

　　2.2  肠道外感染  近年来的研究显示金黄色葡萄球菌的肠毒素不仅可引起食物中毒，在该菌引起的化脓性感染中也起重要作用，李红云［7］等在进行烫伤脓毒血症大鼠急性肺损伤研究时，发现金黄色葡萄球菌肠毒素B型的单克隆抗体能够对烧伤合并葡萄球菌感染的肺损伤起到明显的保护作用，同时金黄色葡萄球菌产生的肠毒素SEB能刺激淋巴细胞大量活化，促使炎症细胞因子产生显著增加，致使炎症细胞浸润，组织坏死，尤其是肺组织中的中性粒细胞聚集更加明显，而肾脏有储蓄和排泄肠毒素的功能，所以毒素对肾脏的损伤也较明显，以至产生对全身其他各器官组织的损伤作用，最后发展到多个器官功能障碍，危及患者生命。

　　2.3  与川崎病的关系  川崎病一般好发于3个月～6岁婴幼儿，主要临床表现为全身性多发性动脉炎，尤以冠状动脉的损害最为常见，严重者危及患儿生命，给家庭和年轻的父母造成很大心理伤害。虽然该病的病因目前还不清楚，但是有研究认为其发病与免疫系统激活有密切关系：由于巨噬细胞、T细胞活化以及细胞因子释放等，导致了以心血管损伤为中心多种抗原刺激后的变态反应，在这一过程中，内皮细胞的游走与血管壁的损伤是诱发本病的最重要因素，它最终能导致冠状动脉瘤以及内腔狭窄。近年研究发现金黄色葡萄球菌肠毒素与川崎病的临床病理密切相关［8］，金黄色葡萄球菌广泛存在于人体各部位，由于幼儿对其抵抗力差，作为条件致病菌合并感染在临床上很常见，感染后金黄色葡萄球菌产生的肠毒素作为超抗原能激活大量的淋巴细胞，产生大量的细胞因子，参与β细胞多克隆活化，使免疫球蛋白合成增加，产生自身抗体，同时可诱导粘附分子在血管内皮细胞上的表达，导致内皮细胞的损伤及游走，这些因素是导致川崎病发生的重要原因。

　　2.4  超抗原作用  金黄色葡萄球菌肠毒素能够以MHC非限制性及TCRγβ特异性的方式激活大量（为普通抗原的数千倍）T细胞并使其增殖。由此引发的应用SE作为超抗原治疗癌症也在积极的研究中［9］。这些具有生物活性的SE通过活化大量的具强大杀伤力的T淋巴细胞（CD4+和CD8+），使其增加释放细胞因子（IL-1，IL-2，TNFα和INF-γ等），通过特异的抗原决定簇与肿瘤细胞结合并使其凋亡，这项研究目前已进行动物实验阶段，如能成功地应用于临床将是恶性肿瘤患者的福音。

　　3  SE的检测方法

　　3.1  动物学试验  经典的方法是采用幼猫和猴作为研究对象，腹腔注射或喂食肉汤培养物或呕吐物，然后观察动物可能出现的各种异常的生理或形态变化，一般4h内受试动物发生呕吐腹泻和体温升高或死亡等现象者，提示SE存在。是测定食物中肠毒素较早采用的一种方法。Sheahan等给恒河猴喂食含SE的溶液，观察到类似于人的腹泻和呕吐等反应。利用猴进行的动物学试验，准确性高，但灵敏度低，猴的来源困难，成本高，有时因个体差异对一份样品的检测需要几只猴试验才能确定，故极大地限制了本方法的应用。采用幼猫作肠毒素试验观察其呕吐反应时，因葡萄球菌产生的其他非肠毒素类产物也可致幼猫呕吐易产生假阳性，特异性不强。此外，小鼠、家兔、猪、狗等其他动物均对SE不敏感或感应性差，无特异性，实用价值低。总之，动物试验因结果判断直观，准确，在某些情况下可采用，但由于实验动物来源困难，灵敏度低，检测结果不够理想等使其应用受到极大的限制，目前常采用免疫血清学方法检测SE。

　　3.2  放射免疫测定法（Radioimmunoassay, RIA）  1968年，Momrae等用RIA检测SE获得成功，此后，很多实验室利用RIA检测培养液和食品提取的肠毒素［6］。放射免疫测定法是建立在标记抗原和非标记抗原对特异性抗体的竞争性抑制反应基础上的，可以将放射性同位素I125等标记到特异性抗体上，用于检测未知样品中的SE；或者将同位素标记到肠毒素抗原上，标记SE与未标记SE和特异性抗体发生竞争结合，被检材料中未标记的SE可抑制标记SE与相应抗体的结合，抑制程度与标本中SE的浓度成正比，然后测定复合物中标记肠毒素的减少程度，可对检样中同型肠毒素进行定量检测。
      
　　RIA法将同位素测定的高灵敏性和抗原抗体反应的高度特异性有效结合起来，特异性强，敏感性高，检测样品中各型SE可达1ng/mL。但RIA需要有放射性废物处理系统，也需要复杂放射性计数设备，从事RIA的工作人员还必须进行专门培训，熟悉技术，还必须有从事该项工作的许可证，这些均限制了RIA法的使用。

　　3.3  酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）  ELISA是利用酶标记的抗原或抗体，在固相载体上进行抗原或抗体的测定。该法自1971年建立后被广泛应用于多种疾病的免疫血清学检测。目前常用双抗体夹心法检测SE［10］，其灵敏度为1ng/mL，检测速度快，4h就可出结果。一般样品（如食品）不需要进行任何前处理，可直接用于SE的检测，已有商品化的ELISA试剂盒，如RIDASCREEN SET（R4101）、TECRA Staph enterotoxin ID Kit等，用于检测SE中的A、B、C、D和E等。Schotte报道［11］一种改良的ELISA方法—快速免疫色析手工操作法（Rapid immunochromatographicbased hand-hold assay）能够在15min之内检测出500pg/ml的SE。
   
　　ELISA具有RIA的灵敏度和各种免疫琼脂扩散法的普遍性与广泛性，无需特异设备，克服了放射免疫检测法的缺点，费用较低。由于此法敏感、简便、快速、技术人员不需进行特别训练，并能分型，是目前较为适用于检测SE的方法。

　　3.4  聚合酶链反应技术（Polymerase Chain Reaction,PCR）PCR是一种在体内模拟自然DNA复制过程，对特定的DNA或DNA片段进行快速扩增的方法。1991年，Johnson等最先设计八对寡核苷酸引物，分别用于检测从临床标本和食品中分离到的产A-E型葡萄球菌肠毒素、TSSTL和表皮剥脱毒素A和B的88株葡萄球菌。随后，Wilson等用PCR方法检测了干燥脱脂奶粉中的葡萄球菌肠毒素的基因entB，entCI和耐热核酸酶基因。1998年，Becker等设计一种多重PCR-EIA法，一套用于检测肠毒素A～E（entA、entB、entC、entE）基因，另一套用于检测表皮剥脱毒素（eta、etb）基因和中毒性休克综合症毒素（tst）基因。PCR技术除了具有核酸分子杂交的优点如特异性强，可从基因水平进行诊断和同时检测大量样品等外，比核酸分子杂交更加敏感，更加快速和更加简便，且易自动化操作［12］。
   
　　综上所述，金黄色葡萄球菌分布广泛，致病力强，是食物中毒和院内感染最为常见的病原菌，耐药菌株和变异菌株不断出现，给临床治疗和疾病预防控制带来了巨大的桃战。因此，我们要广泛深入研究金黄色葡萄球菌肠毒素的致病机理，包括毒素型疾病和超抗原型疾病和快速、经济、实用的检测SE方法。

【参考文献】
  　　［1］ Martin M, Dinges, Paul M, et al. Schlievert Exotoxins of Staphylococcus aureus［J］. Clinical microbiology reviews, 2000.13（1）:16～34.

　　［2］ 周正任.医学微生物学［M］.第6版.北京：人民卫生出版社，2004,135～142.

　　［3］ 历风元，吴鄂生.金黄色葡萄球菌DNA体内抗肿瘤研究［J］.中国医生，2004,6（6）：35～38.

　　［4］ 赵建，丁水军，陆扁，等.48株金黄色葡萄球菌的肠毒素分布及其耐药性研究［J］.中国卫生检验杂志，2005，15（7）：841～842.

　　［5］ 张严峻，张俊彦，梅玲玲，等.金黄色葡萄球菌肠毒素基因的分型和分布［J］.中国卫生检验杂志，2005, 15（6）：682～684.

　　［6］ 李毅.金黄色葡萄球菌及其肠毒素研究进展［J］.中国卫生检验杂志，2004,14（4）：392～395.

　　［7］ 李红云，姚咏明.金黄色葡萄球菌肠毒素B单克隆抗体对烫伤脓毒症大鼠急性肺损伤的影响［J］.中国实验外科杂志，2001, 17（3）：228～229.

　　［8］ Nomura Y, Masuda K, Yoshinaga M. Possible relationship between streptococcal pyrogenic exotoxin A and Kawasaki syndrome in patients older than six months of age［J］. Pediatr Infect Dis, 2003,22（9）：794～798.

　　［9］ Sjoberg A, Wallen-Ohman M, Antonsson P, et al. Identification of the antigenic epitopes in staphylococcal enterotoxins A and E and design of a superantigen for human cancer therapy［J］. Mol Biol, 2003,333（5）：893～905.

　　［10］ 王晶,王林,黄晓蓉.食品安全快速检测技术［M］.北京：化学工业出版社，2002,115～119，150～153.

　　［11］ Schotte U, Langfeldt N, Peruski AH. Detection of staphylococcal enterotoxin B（SEB）by enay me linked immunosorbent assay and by a rapid hand held assay［J］.Clin Lab,2002,48（7-8）：395～400.

　　［12］ 管俊昌，夏佩莹.金黄色葡萄球菌L型产B型肠毒素及其基因的研究［J］.蚌埠医学院学报，2004，29（4）：283～285.

作者单位：贵港市人民医院,广西 贵港 537100.