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【摘要】 目的 探讨惠州地区慢乙肝（CHB）患者拉米夫定治疗与HBV-YMDD变异的发生和发展的关系。 方法 选取在肝病专科就诊的176例CHB患者，在服用拉米夫定前及服药后每半年进行HBV-DNA定量及YMDD变异检测，并选取35份发生YMDD变异和10份野生型YMDD血清样本进行DNA测序。 结果 176例CHB患者样本中，拉米夫定治疗前检出YMDD变异7例（其中YM/YVDD型2例、YVDD型3例、YIDD型2例），变异率3.98%；治疗2年后共检出62例（其中YVDD型9例、YIDD型36例、YM/YVDD混合型9例、YM/YIDD混合型3例、YV/YIDD混合型5例），变异率35.23%。6例CHB患者在拉米夫定治疗过程中其YMDD变异类型会发生改变。 结论 惠州地区CHB患者经拉米夫定治疗，随着病情发展，变异类型可能会发生改变，YIDD可能是最终的变异类型，YM/YVDD、YVDD和YM/YIDD可能都是过渡的变异类型。
【关键词】 拉米夫定 慢性乙型肝炎 乙肝病毒 YMDD变异
Effect of lamizodine on the variation of HBV-YMDD.
LIU Ji-hong, ZENG Hong, CAO Bi-hong, et al.
(Huizhou Municipal Central People’s Hospital, Huizhou 516001, Guangdong, P. R. China)
Abstract：Objective To investigate the correlation of lamivodine with the occurrence and development of HBV-YMDD mutation in chronic hepatitis B(CHB) in Huizhou. Methods There 176 patients from the specialized outpatient service in our hospital received lamivodine treatment and HBV-DNA and YMDD mutation were analyzed before and after treatment for six months. DNA were sequenced with 35 serum samples of YADD mutation and 10 serum samples of wild mutation. Results Out of the 176 serum samples, YMDD mutation was observed in 7 samples (2 samples were YM/YVDD, 3 samples were YVDD, 2 samples were YIDD) with a mutation rate of 3.98%; YMDD mutation were detected in 62 samples a year after treatment (9 samples were YVDD, 36 samples were YIDD, 9 samples were YM/YVDD, 3 samples were YM/YIDD, 5 samples were YM/YVDD) with a mutation ra te of 35.20%. Among 3 patients with YM/YVDD two years after treatment, 2 patients changed to YVDD and a patient changed to YV/YIDD. 2 patients with YVDD were detected a years after treatment, but one patient changed to YIDD and another changed to YV/YIDD two years after treatment. One patient with YVDD was detected with treatment for six months, but changed to YIDD a year after treatment . Conclusion In CHB patients before Lamivodine treatment, the rate of HBV YMDD mutation was 3.98% and 35.20% two years after treatment . the type of mutation may possibly change with development of the disease, YIDD may be the final mutation type, YM/YVDD,YVDD and YM/YIDD may be interim mutation type. The regularity of change may be YMDD→ YM/YVDD→ YVDD(YM/YIDD)→ YIDD.
Key words：Lamivodine; Chronic hepatitis B; Hepatitis B virus ;YMDD mutation
拉米夫定是一种核苷类药物，具有强烈的抑制乙型肝炎病毒（HBV）DNA复制作用。长期服用可使HBV DNA聚合酶活性区（P基因区）发生YMDD变异而出现耐药，影响治疗效果。YMDD主型区发生耐药的点突变通常有两种形式，一种为P基因区第743位G→T，使其编码的550位甲硫氨酸变为异亮氨酸（YMDD→YIDD）；另一种为741位A→G，使550位甲硫氨酸变为缬氨酸（YMDD→YVDD）。为了解本地区CHB患者在拉米夫定治疗过程中发生HBV-YMDD的动态变化情况，我们对近两年来收治的176例CHB患者进行了YMDD变异的动态检测，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 一般资料 病例为2004年6月～2006年5月在广东省惠州市中心人民医院肝病专科门诊就诊的CHB患者，共176例，其中男124例，女52例，年龄18～67岁，平均37.2岁，患者持续服用拉米夫定治疗12个月以上。全部符合2000年9月（西安）第十次全国病毒性肝炎与肝病学术会议修订的病毒性肝炎防治方案中乙型肝炎的诊断标准。
1.2 检测方法
1.2.1 PCR熔解曲线法 根据DNA分子序列不同对应的熔解温度也不同的原理，采用Roche Lightcycler 荧光定量PCR仪及其专用的熔解曲线分析软件检测HBV-YMDD基序变异，试剂由深圳匹基生物工程股份有限公司提供，严格按说明书进行实验操作。结果判断：熔解温度在(50±1.5)℃为野生型（未变异）；(42±1.5)℃为YIDD型的变异；(60±1.5)℃为YVDD型变异；介于YMDD和YVDD之间或出现YMDD和YVDD两个熔解峰则为YM/YVDD混合变异（或叫部分YV变异）；介于YMDD和YIDD之间或出现YMDD和YIDD两个熔解峰则为YM/YIDD混合变异（或叫部分YI变异）；出现YIDD和YVDD两个熔解峰则为YI/YVDD混合变异。
1.2.2 DNA测序法 从62例YMDD变异的血清样本中选取35份和10份野生型YMDD样本送中山大学达安基因股份有限公司进行测序，其中包括YMDD型10例、YVDD型7例、YIDD型13例、YM/VDD混合型8例、YM/IDD混合型4例和YI/VDD混合型3例。
2 结果
2.1 在拉米夫定治疗两年后有62例CHB患者发生YMDD变异，变异率为35.23%，其中YIDD占58.06%、 YVDD占14.52%， YIDD型变异明显高于YVDD型变异。
2.2 6例CHB患者中在拉米夫定治疗过程中其变异类型会发生变化，具体变化情况见表1。
表1 拉米夫定治疗过程中YMDD变异类型变化（略）
2.3 测序分析 送检的45份测序样本中，有42例PCR熔解曲线法结果与测序结果完全一致，总符合率93.3％，另3例PCR熔解曲线法为不完全变异型，而测序法则是相应的完全变异型，结果见表2。
表2 DNA测序法与PCR熔解曲线法结果比较（略）
3 讨论
YMDD变异的检测有多种方法，包括PCR熔解曲线法、DNA测序法等。测序是金标准，但技术和设备要求高，临床不适用；PCR熔解曲线法操作简单、设备要求不高，便于临床应用，通过45份标本与测序法比较，42例结果完全一致，总符合率93.3％，与文献报道相近［1］，另3例结果是：PCR熔解曲线法为不完全变异型，而测序法则是相应的完全变异型，说明PCR熔解曲线法方法可行、结果可靠。
拉米夫定能明显抑制HBV-DNA的复制，是抗HBV治疗的首选药物，但需长期应用，而长期应用后又容易导致HBV-DNA发生YMDD变异而出现耐药，文献报道治疗一年时有16%～32%患者发生耐药变异，2年时为47%～56%，3年时达69%～75%［2］。YMDD变异主要有两种类型，即YIDD和YVDD变异，早期文献报道YMDD的主要变异类型为YVDD［3］，后又有学者研究发现存在YMDD自然变异株，自然变异率在10%～30%之间［4］，YMDD的自然变异类型主要为YVDD，占90%，而在拉米夫定治疗过程中出现病毒学突破者多以YIDD变异为主［5］。近期文献报道YIDD变异类型的比率在上升，占45.4％［6］。我们对176例拉米夫定治疗的CHB患者HBV YMDD变异检测的结果显示,惠州地区CHB患者拉米夫定治疗前HBV YMDD变异率为3.98%；2年的变异率为35.23%，与文献报道［2］相符；但变异类型却以YIDD为主（占58.06%），YVDD只占14.52%，这与文献［3］报道不符，而与近期文献报道相似［6］。我们的研究还发现6例CHB患者在拉米夫定治疗过程中其YMDD变异类型会发生改变，即由不完全变异向完全变异转变；由YVDD向YIDD转变。根据早期文献和近期文献报道的差异及我们的实验结果，我们推测：YIDD变异是YMDD变异的最终模式，耐药性比YVDD更强，临床若检测到患者出现YIDD变异，则应考虑更换或合用其他核苷类药物。早期文献报道YMDD变异类型以YVDD为主而后期报道则以YIDD为主，这可能与拉米夫定广泛应用时间的长短有关，我们的结果YIDD的比率较高（占58.06%），可能与我们医院是较早应用拉米夫定的地区之一有关。还有文献报道YMDD的自然变异类型主要为YVDD，占90%，而在拉米夫定治疗过程中出现病毒学突破者多以YIDD变异为主［7］，不同的变异类型与拉米夫定的抗病毒疗效有很大关系，变异类型可以决定拉米夫定疗程的长短［8］，有学者通过体外细胞模型试验已证实，与YMDD野生型毒株相比，拉米夫定对YVDD毒株的IC50增加了18倍，而对YIDD毒株则增加了106倍以上［9］；另我们的研究结果显示：YMDD会向YM/YVDD再向YVDD转变，YVDD会向YIDD转变，YMDD也会向YM/YIDD再向YIDD转变，同一患者，不同时期YMDD变异类型可能会发生转换，与文献报道［10］YVDD可能只是YMDD向YIDD变异的过渡形式是相一致的，因此认为YMDD变异可能是按如下规律YMDD→YM/YVDD →YVDD（YM/YIDD）→YIDD进行的，这一推测是否正确有待进一步作深入的研究。
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作者单位：惠州市中心人民医院,广东 惠州 516001;惠州卫生学校,广东 惠州 516000.