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【摘要】 目的 探讨Caspase-3和PCNA在肝细胞肝癌的表达及其在肝细胞肝癌发生、发展中的作用。 方法 应用组织芯片技术和免疫组化方法(SP法)检测95例肝细胞肝癌组织、68例癌旁组织和19例正常肝组织中Caspase-3和PCNA的表达。 结果 Caspase-3在肝细胞肝癌中表达阳性率(34.7%)显著低于癌旁组织（79.4%,P<0.01）和正常肝组织(84.2%,P<0.01)；Caspase-3的表达与肝细胞肝癌的组织分级和HBsAg有关(P<0.01,P<0.05),与患者年龄、性别、肿瘤大小和转移无关(P>0.05)。PCNA在肝细胞肝癌中的表达阳性率(68.4%)显著高于癌旁组织（26.5%,P<0.01）和正常肝组织(15.8%,P<0.01)；PCNA的表达与患者组织分级、转移有关(P<0.01,P<0.05)，与年龄、性别、肿瘤大小、和HBsAg无关(P>0.05)。在肝癌组织中Caspase-3与PCNA的表达呈显著负相关(r=-0.598,P<0.001)。 结论 肝细胞肝癌中Caspase-3的低表达与PCNA的高表达在肿瘤的发生、发展过程中可能起重要作用。
【关键词】 肝细胞 肝癌 免度组化 Caspase-3 PCNA 组织芯片
Expression and clinical significance of caspase-3 and PCNA in hepatocellular carcinoma by the application of tissue microarray.
CHEN Lian-zhou, LI Wen, HUANG Xiao-hui, et al.
( The First Affiliated Hospital of Zhongshan University, Guangzhou 510080, Guangdong, P. R. China)
Abstract：Objective To investigate the clinical significance and effects of the expression of caspase-3 and PCNA in the occurrence and development of hepatocellular carcinoma. Methods The expression of caspase-3 and PCNA was detected by tissue microarray and immunohistochemical method in 95 hepatocellular carcinoma tissues,68 parahepatic cancer tissues and 19 normal liver tissues. Results The expressions rate of caspase-3 in hepatocellular carcinoma tissues (34.7%) was significantly lower than that of parahepatic cancer tissues (79.4%,P<0.01)and normal liver tissues (84.2%,P<0.01). The expression of caspase-3 was correlated with Edmondson，s histological grade of carcinoma and HBsAg(P<0.01,P<0.05),but without correlation with patients，age,sex,diameter and metastasis(P>0.05). The expressions rate of PCNA in hepatocellular carcinoma tissues (68.4%) was significantly higher than that parahepatic cancer tissues (26.5%,P<0.01,) and normal liver tissues (15.8%,P<0.01), The expression of PCNA was correlated with Edmondson’s histological grade and metastasis of carcinoma(P<0.01,P<0.05),but without correlation with age,sex, and HbsAg of the patients(P>0.05); The expressions of Caspase-3 was negative correlated with PCNA(r=-0.598,P<0.001). Conclusion The low expression of caspase-3 and a high expression of PCNA may play an important role in the curse of occurrence and progression of hepatocellular carcinoma.
Key words：Tissue microarray; Hepatocellular carcinoma;Immunohistochemitry; Caspase-3; PCNA
传统观点认为恶性肿瘤是细胞失控性无限增殖的结果，现在很多研究表明许多人类恶性肿瘤不仅是一种细胞增殖失控的疾病,而且是一种细胞死亡异常的疾病,机体内正常调节细胞增殖、死亡之间平衡的机制一旦被破坏,肿瘤就可以发生。Caspase家族属于天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶，参与肝细胞癌发生过程中的细胞凋亡异常的病理过程［1］；PCNA是真核细胞DNA合成所必需的一种分子量为36Ku核蛋白,是DNA多聚酶的辅助蛋白,是细胞DNA合成不可缺少的因子，与细胞增殖活动密切相关, 其表达与细胞周期相关，常常被用作评价细胞增殖状态的一种指标［2］。本文应用组织芯片技术和免疫组化方法检测Caspase-3和PCNA蛋白在肝细胞肝癌中的表达，以了解其在肝细胞肝癌发生、发展中的作用。
1 材料与方法
1．1 临床资料 标本来自本院2006～2007年手术切除的肝细胞肝癌100例，肝癌癌旁组织71例，所有患者术前没有经过化疗或放疗。100例肝癌患者，脱片5例，参检95例中男89例，女6例，年龄8～75岁，有转移者47例，肿瘤体积按直径分为≤5cm者28例和＞5cm者67例，病理组织学分级按Edmonndson 标准，Ⅰ级7例，Ⅱ级69例，Ⅲ～Ⅳ级19例，HBsAg阳性72例，阴性23例；癌旁组织和正常组织参检分别为68例和19例；正常对照组19例组织为肝良性疾病手术切除的标本。所有标本在福马林中浸泡8～12 h后石蜡包埋。
1．2 组织芯片制备 供体蜡块切片用HE染色，由病理学家进行定位，以确定有代表性的癌组织和癌旁组织，避开出血坏死及纤维化区域，标记取材部位。用美国Beeeher Instruments公司制造的MTA-1组织芯片仪从供体蜡块穿取直径为1.0mm、长度约为3.0mm组织放入受体蜡块中,制成2块组织芯片模块，以5μm厚度作连续切片，制成组织芯片。
1．3 免疫组化染色 鼠抗人Caspase-3单克隆抗体、PCNA单克隆抗体，购自美国Sanjose公司，免疫组织化学SP试剂盒购自北京中山生物公司，为Zymed公司产品。采用免疫组织化学SP法，严格按照SP试剂盒说明书操作，DAB显色，Mayer，s 苏木素复染、封片。
1．4 对照设置 以PBS代替一抗作阴性对照，以已知Caspase-3和PCNA阳性的肝细胞肝癌组织作阳性对照。
1．5 结果判断 Caspase-3以细胞胞浆染成黄色或棕黄色为阳性细胞；PCNA以细胞核染成黄色或棕黄色颗粒为阳性细胞。每例组织芯片随机观察10个高倍视野，阳性细胞数<10％ 为阴性，10%～25%为（+），25%～75%为（+ +），＞75% 为（+ + +）。+ ～ + + +统称为阳性。
1．6 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件包,行χ2检验或Fisher精确概率计算和Spearman等级相关检验，P<0.05为具有统计学意义。
2 结果
2．1 Caspase-3的免疫组化染色 阳性染色主要定位于细胞浆，呈黄至棕黄色，在肝细胞肝癌中表达阳性率(34.7%)显著低于癌旁组织（79.4%,P<0.01）和正常肝组织(84.2%,P<0.01)，与肝细胞肝癌的组织分级和是否HBsAg阳性有关(P<0.01,P<0.05),与患者年龄、性别、肿瘤大小和转移无关(P>0.05)。见表1。
表1 Caspase-3、PCNA表达与正常组织、癌旁组织和肝细胞肝癌组织临床指标的关系（略）
注:与◆比较,
2．2 PCNA的免疫组化染色 阳性染色主要定位于细胞核，呈黄至棕黄色，在肝细胞肝癌中的表达阳性率(68.4%)显著高于癌旁组织（26.5%,P<0.01）和正常肝组织(15.8%，P<0.01)，与患者组织分级、转移有关(P<0.01，P<0.05)，与年龄、性别、肿瘤大小、和HBsAg无关(P>0.05)。见表1。
2．3 肝癌组织中Caspase-3与PCNA表达的关系 两者表达呈负相关系(r=-0.598,P<0.01),见表2。
表2 Caspase-3、PCNA表达与肝细胞肝癌组织临床指标的关系（略）
图1 Caspase-3在肝细胞肝癌中的表达(免疫组化SP法×200)（略）
图2 PCNA在肝细胞肝癌中的表达(免疫组化SP法×200)（略）
3 讨论
Caspase家族属于天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶,与细胞凋亡密切相关。Caspase-3是其家族中最重要的一员，处于细胞凋亡的共同路径上，是细胞凋亡的关键执行者之一，可参与肝细胞癌发生过程中的细胞凋亡异常的病理过程。正常情况下, Caspase-3在胞质中以无活性的酶原形式存在,只有当许多细胞外凋亡信号使之激活为有活性的Caspase-3时，引起细胞质、细胞核及细胞构架的关键蛋白酶失活，导致细胞凋亡，而如何增加肿瘤细胞的凋亡是肿瘤治疗研究的重要方向［3,4］。本实验应用组织芯片技术和免疫组化方法检测Caspase-3和PCNA蛋白在肝细胞肝癌中的表达，结果显示，Caspase-3在肝细胞肝癌中表达阳性率(34.7%)显著低于癌旁组织（79.4%,P<0.01）和正常肝组织(84.2%,P<0.01),差异有统计学意义， Caspase-3的失表达推测其生物活性在肝癌细胞中受到抑制，导致肝癌细胞不易凋亡，可能有助于肝癌的发生和发展。Caspase-3表达在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ-Ⅳ级肝癌中的阳性率逐渐降低，差异有统计学意义,可能提示癌细胞分化程度高，细胞凋亡机制障碍程度轻。而Caspase-3在HBsAg阴性组中的表达显著高于阳性组，提示HBV病毒感染可能导致了Caspase-3失活。
PCNA是一种与细胞增殖相关的抗原，是真核细胞DNA合成所必需的一种分子量为36Ku的核蛋白,是DNA多聚酶的辅助蛋白。恶性肿瘤的生物学特性之一是异常增殖，PCNA与细胞增殖活动密切相关,可以作为判断和评价原发性肝癌的细胞增殖状态和生物学活性的指［5］。本实验显示，PCNA在肝细胞肝癌中的表达阳性率(68.4%)显著高于癌旁组织（26.5%,P<0.01）和正常肝组织(15.8%,P<0.01)，差异有统计学意义，表明肝癌组织存在明显的细胞增殖和活跃的物质合成，可能与肝癌的发生和发展有关；PCNA的表达在分化差的和伴有转移者明显高于分化好的和不伴有转移者,提示分化差的和伴有转移者的细胞增殖能力强及肿瘤进展快，间接反映肝癌的恶性程度。
现在许多研究表明肿瘤不仅是一种细胞增殖失控的疾病,而且是一种细胞死亡异常的疾病。本研究结果还显示，在肝细胞肝癌组织中，Caspase-3的低表达与PCNA的高表达呈显著负相关关系，提示Caspase-3基因与PCNA的表达可能呈负反馈调节。Caspase-3和PCNA参与了肝细胞癌发生过程中的细胞异常凋亡和增殖的病理过程,在肿瘤的发生、发展过程中可能起重要作用。进一步研究Caspase-3和PCNA之间的关系,以及它们与凋亡、增殖调控基因之间的关系,将有助于对肝癌的发生、发展和治疗提供的新途径。
【参考文献】
［1］ Li P,Nijhawan D,Budihardjo I,et al.Cytochrome C and Datp-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade［J］.Cell,1997, 91(4):479～489.
［2］ Buyukbayram H, Cureoglu S,Arslan A,et al. Prognostic value of PCNA and mutant p53 expression in laryngeal squamous cell carcinoma［J］. Cancer Invest,2004,22(2):195～202.
［3］ Zeiss CJ,Neal J,Johnson EA.Caspase-3 in postnatal retinal development and degeneration［J］.Invest Ophthamol Vis Sci,2004,45(3):964～970.
［4］ Sharma AK,Rohrer B.Calcium induced calpain mediates apoptosis via caspase-3 in a mouse photoreceptor cell line［J］.J Biol Chem,2004,279(34):35564～35572.
［5］ 董敬东,王莉芬.原发性肝癌影像学特征与PCNA、AFP的表达［J］.中国医药导报,2008,5(15):16～18.
作者单位：中山大学附属第一医院, 广东 广州 510080.