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【摘要】 目的 分析与细胞凋亡有关的存活素（survivin）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）基因在IRM-2小鼠辐射抗性中发挥的作用。方法 用RT-PCR方法比较不同剂量γ射线照射后不同时间,IRM-2小鼠及其亲本ICR/JCL及615小鼠survivin和caspase-3 mRNA表达差异。结果 当分别接受1、2及4 Gy γ射线照射后，小鼠survivin mRNA表达变化不大，差异无统计学意义。当接受4 Gy照射后2 h ，IRM-2小鼠caspase-3 mRNA表达明显低于亲本615小鼠（P<0.05），表明IRM-2小鼠凋亡量少于615小鼠。结论 IRM-2小鼠对大剂量辐射诱发的DNA损伤的耐受力强，因此具有较高的辐射抗性。
【关键词】 存活素；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶；RNA，信使；基因表达；细胞凋亡
The mRNA expression of survivin and caspase-3 genes in mice induced by ionizing radiation
WANG Qin,YUE Jing-yin,MU Chuan-jie.Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Tianjin 300192,China
［Abstract］ Objective To investigate the role of survivin and caspase-3 genes related with apoptosis in IRM-2 radioresistance mice.Methods The mRNA expression of survivin and caspase-3 genes in IRM-2 mice and their parental mice ICR/JCL and 615 were measured by RT-PCR after exposure different doses of γ-ray radiation and different postirradiation time.Results The mRNA expression of survivin of mice did not change much after irradiated by 1 Gy、2 Gy and 4 Gy radiation.The mRNA expression of caspase-3 for IRM-2 mice was lower significantly than that of their parent 615 mice（P<0.05）after exposure 2 h postirradiation 4 Gy,which showed the apoptosis amount of IRM-2 mice was lower than that of 615 mice.Conclusion IRM-2 mice were of high radioresistance as they could strongly resist DNA damage induced by high dose radiation.
［Key words］ survivin；caspases；RNA,messenger;gene expression；apoptosis
辐射敏感性是放射生物学界广为关注的重要课题之一，也是探讨辐射损伤及其机制的关键问题。细胞凋亡与辐射敏感性的关系很密切，有研究显示凋亡反应的增加提示细胞具有更大的辐射敏感性［1］。存活素（survivin）是近年来发现的凋亡蛋白抑制因子家族新成员［2］，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）是在细胞凋亡过程中的具体执行者［3］，二者是与细胞凋亡关系密切的基因。IRM-2小鼠是我所培育的近交系小鼠品系，该小鼠突出的生物学特性是具有较强的辐射抗性［4］及较低的染色体畸变率［5］。笔者通过观察电离辐射后，IRM-2小鼠及其亲代ICR/JCL及615小鼠survivin和caspase-3 mRNA表达水平，分析凋亡在IRM-2小鼠辐射抗性中发挥的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 IRM-2小鼠、ICR/JCL及615小鼠，6～8周龄，体质量（20±2）g，雄性，随机分组，每组6只。常规喂养，由我所国家二级动物室培育，级别为清洁实验动物。
1.1.2 主要试剂 Trizol试剂是美国Invitrogen公司产品。Taq DNA聚合酶为北京赛百盛公司产品。SuperscriptⅡ逆转录酶为 Promega公司产品。
1.1.3 主要仪器 137Cs γ射线照射源为加拿大产（型号USD），紫外分光光度计为美国Beckman公司产品（型号DU800）,PCR扩增仪是美国MJ公司产品,Gel Doc 1000凝胶成像仪为美国Bio-Rad公司产品。
1.2 方法
1.2.1 动物照射 IRM-2、ICR/JCL及615小鼠接受1、2和4 Gy137Cs γ射线照射，分别于照射后15 min、1、2 h断颈处死（每个时间点6只动物），提取脾细胞总RNA，对照组小鼠（6只）不照射。剂量率为0.99 Gy/min。
1.2.2 小鼠脾细胞总RNA的提取 按Trizol试剂的说明书提取总RNA，紫外分光光度计进行鉴定，OD 260/OD 280为1.8～2.0。
1.2.3 逆转录反应 反应条件为2.5 μg总RNA、0.1 μg Oligo（dT）15、DEPC水至11 μl，混匀后70 ℃加热10 min，立即冰浴冷却2 min。再加入10×buffer 2 μl、DTT 2 μl、MgCl2 2 μl、dNTPmix 1 μl，42 ℃温育5 min，加入1 μl （200 u）Superscript Ⅱ逆转录酶，42 ℃温育50 min，70 ℃ 15 min终止反应。再加入1 μl RNase H（2 u），37 ℃温育20 min, 终体积为20 μl。
1.2.4 PCR扩增 survivin上游引物5’-gag tcg tct tgg cgg agg-3’，下游引物5’-ctt aga tgt ggc atg tca ctc-3’，扩增片段为509 bp。caspase-3上游引物5’-agt cag tgg act ctg gga tc-3’，下游引物5’-gta cag ttc ttt cgt gag ca-3’，扩增片段为749 bp。同时逆转录扩增β-actin作为内参照，上游引物5’-caa cgg ctc cgg cat gtg c-3’，下游引物5’-ctc ttg ctc tgg gcc tcg-3’，扩增片段为153 bp。反应条件为10×PCR buffer 2.5 μl、MgCl2 1.5 μl、dNTP 0.4 μl、1 u Taq DNA聚合酶、上、下游引物各1 μl、1 μl cDNA模板，终体积为25 μl。94 ℃预变性2 min，94 ℃变性60 s，55 ℃退火90 s，72 ℃延伸90 s，β-actin 25个循环,survivin 30个循环,caspase-3 35个循环。最后72 ℃温育10 min，置4 ℃结束反应。
1.2.5 图像分析 各取PCR产物10 μl,1%琼脂糖凝胶（含0.5% EB） 60 V电泳1 h。采用Doc 1000凝胶成像系统采集图像，用Molecular AnalysisTM软件对电泳条带进行密度扫描。survivin和caspase-3 mRNA表达以该条带黑度占β-actin条带黑度比例表示。
1.3 统计学方法 实验数据以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 RT-PCR扩增目的基因的琼脂糖凝胶电泳结果 见图1。以总RNA为模板和序列特异性引物，经RT-PCR方法扩增survivin和caspase-3基因片段。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，从图1可以看出有3条明亮的条带，与marker比较，估计survivin片段约为500 bp，caspase-3片段大于500 bp，小于但接近900 bp，β-actin片段位于100～200 bp，与预计长度基本一致，表明分别成功扩增出3个基因片段。
图1 PCR扩增survivin和caspase-3基因片段琼脂糖凝胶电泳图（a：β-actin片段;b：survivin片段;c：caspase-3片段）
2.2 γ射线照射后小鼠survivin和caspase-3 mRNA表达 当分别接受1、2及4 Gy γ射线照射后，小鼠survivin mRNA表达变化不大，差异无统计学意义。小鼠caspase-3 mRNA表达随照射剂量的增加呈上升趋势，在1、2 Gy剂量组，小鼠caspase-3变化与其对照组相比差异无统计学意义；当接受4 Gy照射后2 h，小鼠caspase-3 mRNA表达明显高于对照组（P<0.05，P<0.01），IRM-2小鼠与亲本小鼠相比，IRM-2小鼠caspase-3 mRNA表达明显低于615小鼠（P<0.05），表明IRM-2小鼠凋亡量少于615小鼠，见表1、表2表1 γ射线照射后小鼠survivin mRNA表达注：各组间比较，差异均无统计学意义 表2 γ射线照射后小鼠caspase-3 mRNA表达 注：与对照组相比，*P<0.05,△P<0.01；IRM-2与之相比，□P<0.05
3 讨论
caspase-3是半胱氨酸蛋白酶家族成员之一,在细胞凋亡过程中起着重要作用。survivin是新发现的凋亡抑制基因，研究发现其主要通过它的杆状病毒重复序列，与caspase直接或间接作用以实现对细胞凋亡的抑制［6，7］。
在本实验中当接受不同剂量γ射线照射后，小鼠survivin mRNA表达变化不大，可能与采用传统的PCR定量有关。由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性差。因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处，传统的定量方法只能算作半定量。如果采用实时定量PCR方法分析基因表达，相信能得到较好的结果。
辐射所致DNA损伤引发的细胞凋亡，一般认为在受照后几小时内出现凋亡高峰。有的实验［8］发现小鼠受2～6 Gy γ射线在体照射，脾细胞照射后4～8 h出现明显的细胞凋亡峰。本研究发现当接受4 Gy照射后2 h，小鼠caspase-3 mRNA表达水平明显上调，预示发生了凋亡。研究表明，在凋亡的早期阶段caspase-3被激活，最终导致细胞凋亡，但在凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。笔者只分析了2 h内caspase-3的mRNA表达，如果延长至4 h或更长时间，会发现更多有关细胞凋亡的信息。
本实验结果表明当接受4 Gy照射后2 h，IRM-2小鼠caspase-3 mRNA表达明显低于亲本615小鼠，提示IRM-2小鼠凋亡量少于615小鼠。这可能是由于IRM-2小鼠对大剂量辐射诱发的DNA损伤的耐受力强，因此具有较高的辐射抗性。
*基金项目：国家自然科学基金（编号：30270218）
【参考文献】
1 Olive PL,Banh JP,Durand RE.Development of apoptosis and polyp-loidy in human lymphoblast cells as a function of position in the cell cycle at the time of irradiation.Radiat Res,1996,146（6）:595-602.
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3 Chiou SK,Jones MK,Tarnawski AS.Survivin-an anti-apoptosis protein:its biological roles and implications for cancer and beyond.Med Sci Monit,2003,9（4）:143-147.
4 周继文，吴红英，王月英,等.IRM-2近交系小鼠对电离辐射抗性的研究.中国实验动物学报，2001，9（2）：73-77.
5 李进，周继文，吴红英,等.IRM-2近交系小鼠的G-显带核型和自发畸变率的研究.中国实验动物学报，2001，9（3）：178-181.
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8 吴玮，孔宪涛，李莉,等.亚致死剂量γ射线照射后小鼠脾脏阳性淋巴细胞CD95变化规律的研究.中华放射医学与防护杂志,1997，17（5）:305-308.
作者单位：300192 天津，中国医学科学院中国协和医科大学放射医学研究所