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【摘要】 目的 观察毕赤酵母菌表达弓形虫GRA1蛋白免疫效果。 方法 采用皮下注射法免疫接种小鼠，末次免疫后第2周用ELISA检测其特异性抗体水平；流式检测鼠脾淋巴细胞亚群，末次免疫后第3周，用弓形虫RH株速殖子分别攻击感染疫苗免疫组和对照组，观察小鼠感染情况及存活时间。 结果 ELISA结果表明，纯化GS115/pPIC9K-GRA1表达的蛋白和GS115/pPIC9K-GRA1表达的混合蛋白组抗体水平高于佐剂组、NS对照组及GS115/pPIC9K表达的混合蛋白组（P<0.05）；流式结果显示，各组CD4+淋巴细胞细胞数量变化无显著性差异 (P>0.05), 而CD8+淋巴细胞数量则明显增多,纯化GS115/pPIC9K-GRA1表达的蛋白、GS115/pPIC9K-GRA1表达的混合蛋白组、GS115/pPIC9K表达的混合蛋白组及佐剂组明显高于NS组（P<0.05）；小鼠攻击实验表明，与NS及GS115/pPIC9K表达的混合蛋白组相比，纯化GS115/pPIC9K-GRA1表达的蛋白和GS115/pPIC9K-GRA1表达的混合蛋白组小鼠存活时间显著延长(P<0.05)。 结论 毕赤酵母菌表达弓形虫GRA1蛋白免疫小鼠后可诱导特异性抗体产生,CD4+淋巴细胞增殖不明显, 而CD8+淋巴细胞则显著增殖及对弓形虫攻击感染有一定的保护作用。
【关键词】 弓形虫 GRA1 毕赤酵母菌 接种 免疫
Observation on the protective effect of toxoplsma GRA1 protein expressed in Pichia pastoris in mice.
XIE Rong-hua, WU Xiang, FAN Jiu-bo, et al.
(Hunan Bioenvironmental Occupational College, Hengyang 421005, Hunan, P. R. China)
Abstract：Objective To observe the specific immune responses and immunity protection of protein of GRA1 expressed in Pichia pastoris. Methods After preparation and purification of protein ,mice were immunized subcutaneously with GRA1.Two weeks after the last immunization, sera were respectively collected from each group. Leukomonocyte subpopulation was analyzed with BD Flow cytometer, specific antibody levels were measured by ELISA. The mice in immunized groups and control groups were challenged with T.gondii tachyzoites, and then the survival time was compared. Results Two weeks after the last immunization, ELISA showed levels of specific antibody in sera of mice inoculated with purification GRA1 expressed in GS115/pPIC9K-GRA1 and admixture protein expressed in GS115/pPIC9K-GRA1 were significantly higher than admixture protein expressed in GS115/pPIC9K and those in control group mice. The number of CD4+ T cell did not increased apparently compared with each groups(P>0.05). However, CD8+ T cell was sigificant increased than those in NS control group(P<0.01) and the value of CD4+/CD8+ was decreased. After challenging with violent virulence strain of tachyzoites, the mean survival time of immunized mice groups was significantly longer than that in control groups and admixture protein expressed in GS115/pPIC9K. Conclusion It can induce specific antibody response and CD8+ T cell was sigificant increase than those in NS control group and partial protection against challenge of virulence strain of tachyzoites which expressed GRA1 in Pichia pastoris.
Key words：Toxoplasma gondii; GRA1; Pichia pastoris; Protein vaccination; Immunity effect
弓形虫是一种全球分布且广泛寄生于人体及动物有核细胞的专性寄生虫,能引起人兽共患的弓形虫病,该病感染极为普遍,估计全世界至少有1/3的人感染弓形虫,成年人大多为隐性感染,孕妇初次感染可导致流产、畸胎或死胎。弓形虫是一种机会性致病原虫,为免疫功能抑制或缺陷者(如器官移植、恶性肿瘤及艾滋病人) 致死的主要原因之一。此外,受孕家畜也受弓形虫病的严重威胁,给畜牧业造成严重的经济损失。目前尚无有效治疗药物。为了及早预防该病的发生,研制行之有效、廉价方便的弓形虫疫苗迫在眉睫。
本课题组前期工作成功构建了弓形虫pPIC9K-GRA1重组质粒、GS115/pPIC9K-GRA1重组菌 ，并在酵母菌中成功高效表达了GRA1蛋白。本研究将采用皮下注射途径免疫昆明小鼠，初步观察酵母菌表达的GRA1蛋白在小鼠中诱导的保护性免疫应答。
1 材料和方法
1.1 蛋白与菌株 弓形虫RH株为本室传代保种、GS115/pPIC9K-GRA1重组菌表达GRA1蛋白、GS115/pPIC9K重组菌表达混合蛋白为本室诱导表达。
1.2 实验动物 清洁级昆明小鼠，6周龄左右，雌雄各半，体重为(20±2)g，购自中南大学实验动物中心。
1.3 主要试剂 FREUND佐剂购自Sigma公司，HRP标记的羊抗小鼠IgG购自北京博大泰克公司。
1.4 实验动物分组及动物免疫 昆明小鼠75只，随机分为5组。分别为Ⅰ组: 纯化GS115/pPIC9K-GRA1表达的GRA1蛋白加佐剂组，简称GS115/pPIC9K-GRA1纯化组；Ⅱ组:GS115/pPIC9K-GRA1表达的混合蛋白加佐剂组，简称GS115/pPIC9K-GRA1混合蛋白组;Ⅲ组:GS115/pPIC9K表达的混合蛋白加佐剂组，简称GS115/pPIC9K混合蛋白组；Ⅳ组：生理盐水（NS）对照组；Ⅴ组：福氏佐剂(FREUND:PBS=1:1)对照组抗原乳化后经腹部皮下多点免疫3次，每次间隔2周，免疫剂量为100μg /100μl/只。其中FREUND组第1次免疫用完全REUND佐剂，第2次、第3次免疫用不完全FREUND佐剂。每次免疫前及末次免疫后两周用断尾法收集小鼠血清备用。RH株弓形虫攻击后30d存活的小鼠再收集1次血清。
1.5 小鼠血清抗体测定 快速ELISA 法检测各组各次免疫前及末次免疫两周后免疫鼠血清抗体水平。
1.6 鼠脾细胞亚群测定 常规方法制备小鼠脾细胞悬液（密度为1.0～1.9×106个/ml）于BD公司专用试管中，每只小鼠设两管，1 500rpm离心5min，吸去900μl上清；加PE-CD8α、FITC-CD4、PE-Cy5-CD3e （每种单抗浓度已调整为0.05μg/μl）单抗各5μl，用旋涡振荡器混匀10sec，室温避光放置30min，1 500rpm离心5min，弃上清，每管加入2ml PBS溶液，用旋涡振荡器混匀10sec，1 500rpm离心5min，弃上清；用PBS溶液重复洗涤一次；加1%多聚甲醛100μl，用旋涡振荡器混匀10sec，在BD FACSCalibur流式细胞仪上用CELLQuest软件获取CD4+、CD8+细胞数量，并计算CD4+与CD8+比值。
1.7 攻击感染实验 末次免疫后第3周，实验组和对照组小鼠经腹腔注射弓形虫RH株速殖子（500个/鼠），观察记录小鼠的感染情况和死亡时间。
1.8 统计学处理 所有实验数据以x±s表示，用SPSS 12.0统计软件处理，采用Excel 2003制图。检验水准为P<0.05。
2 结果
2.1 免疫鼠血清特异性抗体的检测 将各次免疫前及末次免疫两周后小鼠血清作1:100稀释后，用ELISA法检测各组小鼠血清GRA1特异性抗体水平，结果见表1，结果显示GS115/pPIC9K-GRA1纯化组和GS115/pPIC9K-GRA1混合蛋白组抗体水平高于GS115/pPIC9K混合蛋白组、生理盐水对照组和福氏佐剂对照组（P＜0.05)。
表1 各组小鼠血清抗体水平（略）
Table 1 Levels of antibody of mice serum in different groups
注：▲为与生理盐水和福氏佐剂组比，P＜0.05；*为与GS115/pPIC9K混合蛋白组比，P＜0.05;★为与GS115/pPIC9K-GRA1混合蛋白组比，P＜0.05。
2.2 鼠脾细胞亚群测定 小鼠末次免疫后第2周，取小鼠脾细胞进行淋巴细胞亚群测定。各组CD4+细胞数量无显著性差异（P>0.05）;而CD8+细胞数明显增多，CD4+/CD8+比值明显减少，GS115/pPIC9K-GRA1纯化组、GS115/pPIC9K-GRA1混合蛋白组、GS115/pPIC9K混合蛋白组、福氏佐剂组CD8+细胞数明显高于NS组（P＜0.01)，结果见表2。
表2 小鼠脾细胞淋巴细胞亚群检测（略）
Table 2 Detection of leukomonocyte subpopulation of mouse splenoctes
注：▲为与生理盐水组,P＜0.01。
2.3 抗攻击感染的免疫保护作用 于末次免疫后第3周每只小鼠经腹腔注射500个速殖子， GS115/pPIC9K-GRA1纯化组和GS115/pPIC9K-GRA1混合蛋白组小鼠存活时间明显长于GS115/pPIC9K混合蛋白组、NS及福氏佐剂对照组（P＜0.05)。见表3。
3 讨论
弓形虫疫苗经历了全虫疫苗、基因工程疫苗及核酸疫苗。近年来利用基因工程技术在体外表达目的蛋白且具有一定的免疫保护性。但由于蛋白在原核细胞中表达不能折叠成天然构型,其分子结构、理化性质、生物学功能与天然蛋白均有差异,且难以分离。为了获得效果更好的重组蛋白,Xiong 等［1］将SAG1基因和GST基因重组至辛得比病毒载体上,在真核细胞幼仓鼠细胞中进行了表达。其后,Kim 等［2］将SAG1 基因在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达了接近天然构型的SAG1蛋白,这些重组蛋白可被天然蛋白血清及人工免疫血清有效识别。近年来，利用酵母表达系统表达外源蛋白日益增多，并通过体内外实验证明具有一定的免疫活性如肖景莹［3］用酵母菌表达的重组蛋白HGXPRT具有很强的免疫原性，能诱导实验动物产生明显的体液免疫。
表3 速殖子攻击后各组小鼠存活时间（略）
Table 3 The survival time of mice in different Groups after challenged with tachyzoite
注：▲为与GS115/pPIC9K混合蛋白组、福氏佐剂组、NS组比，P＜0.05；*为与GS115/pPIC9K-GRA1混合蛋白组比，P＜0.05。
本研究显示，GS115/pPIC9K-GRA1纯化组和GS115/pPIC9K-GRA1混合蛋白组抗体水平高于GS115/pPIC9K混合蛋白组、生理盐水对照组和福氏佐剂对照组，且随着免疫次数的增加抗体水平增高。淋巴细胞亚群测定结果表明, CD4+细胞数无明显增殖，CD8+细胞数则显著增殖，CD4+/CD8+比值明显减少。淋巴细胞的增殖则与细胞毒杀感染靶细胞有关。此外，GS115/pPIC9K混合蛋白组小鼠CD8+细胞数也显著增殖，可能是其它蛋白引起的非特异性反应。GS115/pPIC9K-GRA1纯化组小鼠受攻击后存活时间明显延长，有2只小鼠存活10d，GS115/pPIC9K-GRA1混合蛋白组小鼠受攻击后存活时间也有延长，且该两组抗体水平及CD4+与CD8+比值变化趋势也支持了这一点。
细胞介导免疫在小鼠等宿主抗弓形虫感染中起极其重要的作用［4］，在IFN-γ的调节协同作用下，CD8+T的分化成熟，进而对弓形虫速殖子感染的靶细胞产生细胞毒作用［5］。CD4+细胞Th1亚群分泌IL-12、IFN-γ和TNF-α等多种细胞因子，而巨噬细胞的活化也释放IL-12，促进IFN-γ的合成。因此，CD4+CD8+细胞在抗弓形虫的急性感染中具有重要的作用，而通过检测CD4+与CD8+比值及细胞因子水平可以反应细胞免疫功能的变化。
由上可见，酵母菌表达的GRA1蛋白免疫小鼠具有一定的免疫保护作用，免疫鼠受RH株速殖子攻击后存活时间明显延长，由于酵母表达系统易培养且表达量高，可进行疫苗大批量生产，为获得更好的免疫效果，下一步可构建弓形虫多表位疫苗转化至酵母菌，改进发酵工艺，摸索最佳表达条件，提高表达量。
【参考文献】
［1］ Xiong C, Grieve RB, Kim K, et al. Expression of Toxoplasma gondii P30 as fusions with glutathione S2transferase in animal cells by sindbis recombinant virus［J］. Mol Biochem Parasitol,1993,61(1)：143～145.
［2］ Kim K, Bulow R, Kampmeier J, et al. Conformationally appropri2 ate expression of the Toxoplasma antigen SAG1 (p30) in CHO cells［J］. Infect Immun,1994,62：203～209.
［3］ 肖景莹，张冬梅，蔡连顺,等.恶性疟原虫重组蛋白HGXPRT免疫原性及免疫保护作用的研究［J］.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2006，24（3）：192～195.
［4］ Denkers EY，Gazzinelli RT. Regulation and function of T-cell-mediated immunity during Toxoplasma gondii infection［J］．Clin Microbiol Rev，1998，11(4):569～588.
［5］ Gazzinelli RT，Hakin FT，Hieny S，et al．Synergistic role of CD4+ and CD8+ T lymphocytes in IFN-gamma production and protective immunity induced by an attenuated T. gondii vaccine［J］．J Immunol，1991，146(1):286～292.
作者单位：湖南环境生物职业技术学院，湖南 衡阳 421005; 中南大学湘雅医学院寄生虫学教研室，湖南 长沙 410078.