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【摘要】 目的 探讨2型糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）患者细胞黏附分子（Cell adhesion molecules CAMs）的表达水平与肾脏微血管病变及尿白蛋白的相关性关系。 方法 采用酶联免疫法、流式细胞术和放射免疫法分别测定95例2型糖尿病患者（其中65例DN）和35例健康对照者外周血中SICAM-1水平及CD11b 、CD62P、CD63阳性表达率和尿微量白蛋白排泄率（Urinary Albumin Excretion,UAER）。 结果 糖尿病各组SICAM-1水平和CD11b 、CD62P、CD63的阳性表达率均明显高于对照组（P<0.05及0.01）；微量蛋白尿组和临床蛋白尿组的SICAM-1水平和CD11b、CD62P、CD63 阳性表达率与未并发肾病组（正常蛋白尿组）比较，均随着病情的加重而增加，差异均有显著性（P<0.05及0.01）；相关分析SICAM-1水平和CD11b 、CD62P、CD63的阳性表达率均与UAER呈正相关（r分别为0.576，0.489，0.445，0.463，P<0.05）。 结论 2型糖尿病患者CAMs的高表达与肾脏微血管病变密切相关，并能反映DN严重程度，联合UAER检测对诊断、观察病情及预防肾脏微血管病变的发生发展均有意义。
【关键词】 糖尿病肾病 非胰岛素依赖型 微血管病变 内皮细胞 黏附分子 尿白蛋白
Expression of cell adhesion molecules in type 2 diabetes patients with nephrotic microangiopathy.
LIU Cong，DING Fang-lin,LI Li-wen.
(The Shenzhen Municipal Second People’s Hospital,Shenzhen 518035,Guangdong, P.R.China)
Abstract：Objective To explore the correlation of expression of cell adhesion molecules (SICAM-1, CD11b,CD62P, CD63) in Type 2 diabetes patients with nephrotic microangiopathy and urine albuminuria. Methods The expression of CD11b, CD62P and CD63 were determined by flow cytometry (FCW), SICAM-1 was determined by ELISA, Urine albuminuria was determined by RIA, 95 patients(including 65 patients with nephrotic microangiopathy), and 35 healthy people were determined. Results The levels of expression of cell adhesion molecules in all type 2 diabetes patients were significantly higher than that in healthy controls(P<0.05-0.01)； the expression of cell adhesion molecules in microalbuminuria and clinical albuminuria patients were significantly higher than that in normal albuminuria patients without nephrotic microangiopathy(P<0.05-0.01), the expression of the four molecular markers was increased along with the progress of the disease . the expression of SICAM-1, CD11b, CD62P and CD63 were all correlated with urine alumin excretion (UAER)（P<0.05）. Conclusion The enhanced expression of CAMs in type 2 diabetes patients aree closely associated with the nephrotic microangiopathy and correlated with severrity degree of DN,combined UAER to detect was useful for diagnosis and monitoring the clinical course of DN,avoiding nephrotic microangiopathy.
Key words：Diabetic nephropathy; Non-insulin-dependent;Microangiopathy;Endothelium cell; Cell adhesion molecules;Urine albuminuria
糖尿病肾病（Diabetic nephropathy, DN）是2型糖尿病主要的慢性微血管并发症之一，是终末期肾功能衰竭的主要病因，也是患者致残、致死的重要原因之一，由于其病因机制复杂，至今尚未明了。DN早期临床症状并不明显，而尿微量白蛋白排泄率（Urinary Albumin Excretion,UAER）诊断DN的敏感性有限，确诊时多为中晚期，病变常不可逆，故早期诊断并有效防治极为重要［1］。现通过检测糖尿病患者细胞黏附分子（Cell adhesion molecules CAMs）的表达水平来探讨其在早期肾脏微血管病变诊断的价值以及和尿白蛋白的相关性。
1 资料与方法
1.1 研究对象 2型糖尿病95例（男49例，女46例），系我院2006年12月～2007年 11 月住院病人，均符合1999年WHO制定的糖尿病诊断标准［3］。年龄39～72岁，平均59岁，病程6个月～18年，平均10.7年。所有患者无感染、肿瘤、组织损伤，无心、肺、肝功能不全和脑血管意外，无糖尿病急性并发症，观察前一周内停服钙离子拮抗剂、血管紧张素II受体拮抗剂及血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）。根据本实验研究要求和24h尿白蛋白排泄率（UAER）分为3组：未并发肾病组即正常蛋白尿组(UAER<30mg/24h)30例，并发肾病微量蛋白尿组(UAER 30～300mg/24h )33例，并发肾病临床蛋白尿组(UAER>300mg/24h)32例，正常对照组35例（男19例，女16例）为同期健康体检正常者，年龄37～71岁，平均57岁。
1.2 标本采集 各组均清晨空腹静脉采血4ml，2ml不抗凝以2 000r/min离心15min，分离血清-70℃冻存备检（sICAM-1）。 2ml注入含有20μl 10% EDTAK2的试管中，轻轻混匀(CD11b、CD62p、CD63)。所有研究对象每人留取24h尿液检测尿白蛋白排泄率。
1.3 方法
1.3.1 sICAM-1采用ELISA双抗体夹心法，试剂购自美国ENDOGEN公司，以芬兰RT-2100C多功能自动酶标仪测定，严格按试剂盒及仪器说明书操作。
1.3.2 CD11b、 CD62p和CD63采用流式细胞术（FCM），美国Beckman Coulter EPICS-XL型流式细胞分析仪测定，试剂由美国Beckman Coulter公司提供. 2ml静脉血，EDTA-K2抗凝；立即制备供流式细胞仪检测的样本，测定管中加入CD11b-PE或CD62p- FITC、 CD63- FITC，对照管加入鼠抗人IgG1-PE或鼠抗人IgG1- FITC.当天测定。分别收集1万个细胞和1万个血小板，用LYSYS-II软件分析CD11b和CD62p、CD63的阳性表达百分率。
1.3.3 UAER采用放射免疫法，上海SN-697全自动双探头放射免疫γ计数器检测。尿蛋白测定用天津九鼎尿白蛋白试剂盒,严格按试剂盒及仪器说明书操作。
1.4 统计学处理 数据用均数±标准差表示，采用SPSS11.0统计软件包进行方差分析及t检验和行Kruskal-Wallis非参数检验及直线相关分析。
2 结果
2．1 糖尿病各组SICAM-1水平和CD11b 、CD62P、CD63的阳性表达率均明显高于对照组（P<0.05及0.01）；微量蛋白尿组和临床蛋白尿组的SICAM-1水平和CD11b、CD62P、CD63 阳性表达率与正常蛋白尿组比较，均随着病情的加重而增加，差异均有显著性（P<0.05及0.01）。见表1。
表1 糖尿病各组患者细胞黏附分子和尿白蛋白排泄率变化（略）
Tab 1 Expression of CAMs and UAER in Type 2 diabetes patients
注:与对照组比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01;与未并发肾病组比较,?P<0.05,??P<0.01。
2．2 各试验指标的相关分析 相关分析SICAM-1水平和CD11b 、CD62P、CD63的阳性表达率均与UAER呈正相关（r分别为0.576、0.489、0.445、0.463，P均<0.05）。
3 讨论
2型糖尿病肾脏微血管病变与患者血栓前状态、血管内皮损伤、血小板粘附、凝集和释放等活化功能增强及抗凝功能减退等因素密切相关，而细胞表面粘附分子(CAMs)的表达增加是白细胞激活、内皮细胞损伤和血小板活化的标志，慢性高血糖状态是引起血管病变慢性并发症的基本因素［3］。经过非酶糖基化等一系列作用刺激患者体内产生的大量白细胞介素-1（IL-1），肿瘤坏死因子（TNF）等炎性细胞因子。CAMs在静息状态下一般不表达，经过IL-1、TNF等的诱导下则会表达增强。表达在白细胞、血管内皮细胞和血小板上的CAMs（CD11b 、ICAM-1和CD62P、CD63等）使中性粒细胞、单核细胞黏附并浸润到炎症组织或动脉硬化灶，参与炎症反应，血小板活化、黏附、聚集，形成微血栓，最终导致肾组织损伤、微血管病变等一系列病理过程［4］。
CD11b是白细胞黏附分子整合素β2亚家族成员，它通过与其配体-内皮细胞表达的细胞间黏附分子（ICAM-1，CD54）相互作用而介导白细胞与内皮细胞黏附，此为炎症早期反应，是血管损伤的关键步骤。血小板α颗粒膜糖蛋白(CD62p)属选择素家族的粘附分子,是一种分子量为140kDa的膜糖蛋白,定位于血小板α颗粒和血管内皮细胞的Weibel-Palade小体内,当血小板和内皮细胞受到炎症、损伤等刺激后表达显著增加. 血小板溶酶体膜糖蛋白(CD63), 是一种分子量为40～50kDa的α颗粒膜糖蛋白,血小板活化时可随脱颗粒反应而表达在血小板表面,目前此蛋白已与CD62p同时被用于血小板活化的研究中,作为其活化或血栓形成的特异标志［5］。当大量白细胞与内皮细胞粘附时，白细胞又释放IL-1、TNF等趋化因子吸引更多白细胞和血小板粘附内皮，导致微循环堵塞，形成缺血-炎症恶性循环。激活的白细胞释放氧自由基，损伤血管内皮，导致血小板聚集。中性粒细胞释放的弹性蛋白酶损害肾脏血管内皮细胞，增加其通透性引起蛋白尿临床表现［6］。本研究结果显示未并发肾病组患者的sICAM-1、CD11b、 CD62p和CD63表达水平即与对照组有显著性差异（P<0.05及0.01），并且随着病情的发展加重，尿白蛋白排泄率的增加，其表达水平也随之增高，在微量蛋白组和临床蛋白尿组患者的CAMs表达水平与未并发肾病组比较时也存在显著性差异（P<0.05及0.01），而且均与UAER增高呈正相关（P<0.05），说明糖尿病患者在出现尿白蛋白之前已有内皮损伤,存在微血管功能障碍, 随着sICAM-1、CD11b的表达异常增加，使得白细胞对血管内皮细胞造成的损害也更为严重；糖尿病患者发生后即可能有血小板过度活化,且当出现肾脏微血管病变时更明显，这表明随着微血管病变的进展，血小板黏附聚集增强，其释放较多的活性物质及血栓素(TXA),极易形成微血栓,微血栓又进一步促进血小板活化,加剧CD62p和CD63介导的滋养血管栓塞、缺血缺氧导致肾脏受损及引发内皮细胞炎性反应致肾小球硬化，血供下降，最终导致糖尿病微血管病变的形成［7］。
目前UAER是临床公认作为判断糖尿病肾脏(DN)损害的严重指标，但其准确性受很多因素影响，需反复检测，一旦患者出现临床或实验室指标异常，肾组织已有明显病理改变［8］，说明UAER对DN的早期诊断敏感性有限，本研究也显示在未并发肾病组患者SICAM-1水平和CD11b、CD62P、CD63的阳性表达率均明显高于正常对照组（P<0.05及0.01）, 而且随着病情的加重表达水平也随之增加，说明CAMs能更早、更有效地了解和监测微血管病变病情，和UAER联合检测能提高患者微血管病变的诊断敏感性，及早预防病情的发展。
综合上述，本研究表明CAMs的高表达造成的白细胞激活、内皮细胞损伤、血小板活化与2型糖尿病患者肾脏微血管病变的发生发展密切相关。SICAM-1、CD11b、CD62P、CD63的表达水平在一定程度上可反映患者微血管病变情况，它们均与UAER正相关。在临床上，除对2型糖尿病肾病患者控制血糖外，可望通过有选择性调节CAMs分子功能，抑制血小板活化，来阻止细胞浸润、炎症反应及肾小球硬化，降低患者UAER，以缓解或延迟患者微血管病变的发生发展均有重要意义。
【参考文献】
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作者单位：深圳市第二人民医院，广东 深圳 518035.