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【摘要】 目的 建立荧光定量RT-PCR技术用于检测手足口病的肠道病毒。方法 利用TaqMan技术，设计一对共引物及探针，建立、优化反应体系后，构建质粒标准品，利用10倍稀释法建立相对定量标准曲线，根据TCID50倍比稀释，建立灵敏度曲线。特异性检验后利用临床标本与传统的RT-PCR法进行比较。结果 定量标准曲线的灵敏度为105/μl(R2=0.999)，PCR扩增效率为94%。灵敏度曲线显示检测到的最低浓度值为5.0TCID50/ml(R2=0.99)，PCR扩增效率为97.6%。荧光RT-PCR检出率为80.9%，显著高于RT-PCR（检出率为62.92%）。结论 研究建立的荧光定量RT-PCR方法检测肠道病毒敏感性高、特异性好、效率高，可以作为肠道病毒的快速检测方法。
【关键词】 手足口病；肠道病毒；荧光定量RT-PCR
Rapid detection of pathogen from hand foot mouth disease by real time quantitative RT-PCR.
HE Ya-qing, HE Li-yun, YAO Xiang-jie, et al.
1.Shenzhen Municipal Center for Disease Control and Prevention, Shenzhen 518100, Guangdong, P. R. China
Abstract：Objective To develop real time quantitative RT-PCR for rapid detection of enterovirus from hand- foot- mouth disease. Methods TaqMan technique was used and a set of universal primers and probe were designed, Real-time RT-PCR for specific sensitive detection of Enterovirus was established. The positive recombinant plasmid was constructed and was used as standard, after ten-fold dilutation, it was used to make quantitative standard curve, TCID50 was diluted ten-fold and then used to make sensitivity standard curve. After specificity was determined clinical specimens were detected to compare real time RT-PCR with traditional RT-PCR. Results The sensitivity of the assay was 105/μl and the regression coefficient was 0.999 of the quantitative standard curve. The sensitivity was TCID50 and the regression coefficient of the sensitivity standard curve was 0.99. Positive rate of real time RT-PCR is 80.9%,and that of RT-PCR is 62.92%.There is signifantly statistical difference. Conclusion A real time quantitative RT-PCR for detection of enterovirus have successfully developed and it has high sensitivity, good specificity and high efficiency, thus it can be used cor rapid detection of enterovirus.
Key words：Hand-foot-mouth disease; Enterovirus; Real time quantitative RT-PCR
肠道病毒是一组没有包膜的小RNA病毒，包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒A、B、埃可病毒、肠道病毒68-71、72型。手足口病的主要病原为肠道病毒71型(Enterovirus type 71，简称 EV71)和柯萨奇A16(Coxsakie A16，简称CoxA16)。托幼机构是手足口病流行、暴发的主要场所，5岁以下儿童比较容易受到感染，3岁以下比较容易出现并发症，包括无菌性脑膜炎、脑炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病等［1］。肠道病毒感染的实验室诊断金标是病毒培养，但病毒培养既繁琐又费时。近年来建立了传统的RT-PCR方法费时，只能半定量或者需要特定的检测方式，此外，RT-PCR容易造成污染。因此，急需建立一种简单、快速可检测多种肠道病毒的诊断方法。本研究采用Taqman技术建立的荧光定量RT-PCR方法具有敏感性高、特异性强和快速等优点，可以作为肠道病毒的日常临床诊断方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 毒株
灭活的脊髓灰质炎病毒PolioⅠ、PolioⅡ、PolioⅢ由广东省疾病预防控制中心提供，EV71、CA16、柯萨奇A24、轮状病毒、诺如病毒均由深圳市疾病预防控制中心微检中心保存。
1.1.2 标本的采集
2006年的1～12月份，收集深圳市手足口病等肠道病毒疑似病例粪便标本89份，保存于-80℃。
1.1.3 主要试剂
One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit 为TaKaRa生产，High Pure Viral RNA Kit 购于Roche公司，Two Step RT-PCR 试剂盒为TaKaRa公司产品，PGMT-easy vector 购于Promega公司，QIAquick Gel Extraction Kit 购于QIAGEN公司，Cycle-Pure Kit 为OMEGA生产。Plasmid Mini Kit Ⅰ购于OMEGA公司。
1.1.4 荧光PCR的引物和探针
引物和探针均根据GeneBank发表的肠道病毒基因设计而成，上游引物为：EVF: 5’-CCCTGAATGCGGCTAATCC- 3’,下游引物为：EVR: 5’-ATTGTCACCATAAGC AGCCA- 3’,TaqMan探针为：EV Probe: 5’FAM - AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTT C- TAMRA 3’,扩增片断长度为144bp。并用NCBI数据库进行BLAST同源性比对验证。探针的5’端用FAM荧光基团标记，3’端用TAMRA淬灭集团标记。引物和探针均由大连宝生物公司合成。
1.2 方法
1.2.1 病毒RNA提取
取200μl粪便上清或病毒培养液，提取过程按High Pure Viral RNA Kit说明书。提取的RNA保存于-80℃，备用。
1.2.2 RT-PCR检测EV71和 CA16
以病毒RNA为模板，用随机引物，经AMV逆转录酶42℃反转录30min， 94℃变性3min后进行PCR，用TaKaRa PCR Kit进行RT-PCR反应。反应条件为94℃预变性5min；94℃变性45sec,50℃退火45sec,72℃延伸1min,34个循环；72℃延伸10min；用EV71和 CoxA16特异性引物进行扩增。PCR后，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析结果，特异性片段长度分别为507bp和880bp。
1.2.3 荧光定量RT-PCR反应条件优化
反应体系如下：25μl反应体系，分别包括：2×One Step RT-PCR Buffer 12.5μl, TaKaRa Ex Taq HS 0.5μl, PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5μl, EVF 200nM, EVR 200nM, EV Probe 120nM, RNA 2μl, dH2O 7.5μl, 一共25μl。反应条件如下：42℃ 5min → 95℃ 10sec →［95℃ 5sec, 60℃ 40sec］共45个循环。采用ABI7500荧光定量PCR仪进行扩增，延伸阶段收集荧光。
1.2.4 重组质粒pGEM -T Easy Vector的构建及鉴定
靶基因的扩增及纯化：用EV F1 5’- GGCCCCTGAATGCGGCTAAT- 3’,EV R1 5’- CACCGGATGGCCAATCCAA- 3’进行普通RT-PCR。先将RNA逆转成cDNA,然后按以下体系进行PCR反应：10×PCR Buffer 2.5μl, dNTP 2μl, Taq E 0.25μl, 10μM EV F1 1μl, 10μM EV R1 1μl, dH2O 16.25μl, cDNA 2μl, 一共25μl。反应条件为：94℃ 5min→［94℃ 45sec, 50℃ 45sec, 72℃ 1min 30sec］共34个循环→72℃ 10min→4℃,保存。取少量PCR产物进行电泳鉴定，均跑出190bp条带。将PolioⅡ、PolioⅢ、EV71、CA16 PCR产物用Cycle-Pure Kit进行回收。将PolioⅠ电泳产物用QIAquick Gel Extraction Kit进行胶回收。 重组质粒的构建：用EV71构建质粒。将PCR产物分别与pGEM -T Easy Vector 进行连接。16℃连接5h。构建克隆载体。将连接产物转化入E coli JM109感受态细胞内，在氨苄青霉素平板上进行蓝白斑筛选，用灭菌牙签挑取阳性单个菌落接种到液体培养基中，37℃振荡过夜。取1.5ml菌液用Plasmid Mini Kit Ⅰ提取重组质粒DNA。获得50μl提取液。具体操作步骤按试剂盒说明书进行。将质粒保存于-20℃。将重组质粒进行酶切，根据载体上的酶切位点选择EcoR Ⅰ进行酶切。37℃，酶切2h。将酶切产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，可见目的条带。进行PCR鉴定。用EV F1和EV R1上下游引物进行扩增，质粒为模板，进行普通RT-PCR，反应条件如上，进行鉴定。均跑出190bp条带，说明成功构建目的质粒。将质粒保存于-20℃，备用。
1.2.5 特异性检验
选择实验室保存的PolioⅠ、PolioⅡ、PolioⅢ、EV71-SHZH98、CA16、CA24重要肠道病毒标准株进行阳性检验，选择轮状病毒和诺如病毒进行阴性检验。
1.2.6 荧光RT-PCR灵敏度标准曲线的建立
取EV71标准株作为代表建立定量标准曲线。将提取的质粒用双蒸水稀释，测定其在260nM 和280nM 处的OD值，计算其拷贝数/μl，以10倍倍比稀释成5个浓度点（EV71: 5.78×108、5.78×107、5.78×106、5.78×105、5.78×104拷贝/μl）作为模板,并设阴性对照，绘制定量标准曲线。
根据病毒的TCID50建立荧光RT-PCR灵敏度曲线。VERO细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5% CO2培养箱中培养。用病毒感染VERO细胞。将病毒原液用细胞维持液做10倍系列稀释至10-8。在96孔无菌细胞培养板上，每孔加50μl工作细胞液（106个细胞/ml），加50μl病毒稀释液，每个稀释度作8个孔，每块板设4孔正常细胞对照。细胞培养条件同上。从48h开始隔日用倒置显微镜观察记录细胞病变，连续观察两星期。细胞CPE病变在病毒梯度变化明显。按Karber方法计算EV71的TCID50分别为5.023×107。取一个单位的TCID50病毒RNA，作10倍倍比稀释，稀释为100～10-6。取200μl各个稀释度的培养液，提取病毒RNA，提取方法同上。将上述RNA作为模板，设阴性对照，绘制荧光RT-PCR灵敏度曲线［2,3］。
2 结果
2.1 特异性检验
所有对照经建立的体系检验，PolioⅠ、PolioⅡ、PolioⅢ、EV71、CA16、CA24均观察到荧光信号增强，阳性率100%。轮状病毒、诺如病毒、阴性对照均未观察到荧光信号增强,见图1。说明建立的方法具有良好的特异性，无假阳性结果。
2.2 定量标准曲线的建立
用10倍倍比稀释的标准模板作定量标准曲线，EV71最低检测限为105/μl。曲线斜率为-3.474，在Y轴截距为53.67(R2=0.999),说明各个浓度的相关系数非常好。PCR扩增效率为94%，说明PCR反应对模板的扩增很完全。
2.3 荧光定量RT-PCR灵敏度曲线
灵敏度分析采用TCID50灵敏度分析，根据TCID50滴定的结果倍比稀释成不同浓度的稀释液做灵敏度曲线。选EV71为代表株分析。EV71荧光定量RT-PCR反应的曲线如图2所示。标准病毒等比例稀释液实时荧光RT-PCR结果呈现规律的Ct值变化，扩增曲线线性较好，说明仪器参数稳定。以5.023×100～10-6TCID50绘制标准曲线。本体系检测到的最低浓度值为5.0TCID50/ml。以已知病毒的TCID50浓度为横坐标，以RT-PCR反应的Ct值为纵坐标，绘制病毒荧光RT-PCR灵敏度曲线。获得的标准曲线为：y=-3.381X+16.40(R2=0.99)，曲线斜率为-3.381，说明各个浓度的相关系数非常好。PCR扩增效率为97.6%，说明PCR反应对模板的扩增很完全。
2.4 临床标本检验
用RT-PCR和建立的荧光RT-PCR检测 89份手足口病例的粪便标本，荧光RT-PCR阳性结果为72份，检出率为80.9%。RT-PCR检出56份阳性，检出率为62.92%,两者的差异有统计学意义（χ2=29.3，P<0.05）,见表1。荧光RT-PCR检出率高于普通RT-PCR，符合率为79.78%，结果表明，研究建立的荧光RT-PCR方法具有灵敏、准确、特异性等优点。可以用于日常疑似肠道病毒感染的临床标本的筛检工作。表1 RT-PCR和荧光RT-PCR检测结果比较（略）
3 讨论
手足口病严重危害儿童健康，其病原为肠道病毒，主要由柯萨奇病毒A16和肠道病毒71型（EV-71）引起，此外，CoxA10、A5、A7、A9、A4、A2以及CoxB1-5 等型别的病毒致病流行也有发生。肠道病毒感染常引起多种不同的表现，80%～92%的病毒性脑炎脑膜炎病原以肠道病毒为主，10%左右的中枢神经系统受侵犯的患者有神经方面后遗症［4］。肠道病毒最常用的监测方法是病毒分离培养。然而，分离培养一个周期获得阳性结果需要5～7d，获得阴性结果需要10d，此外，细胞培养有时不能分离某些病毒株［5,6］。RT-PCR可用于监测肠道病毒，它可以检测出细胞培养不能分离的病毒株，但通常需要1d的时间。肠道病毒感染者需要住院及治疗，诊断延误可导致治疗费用急剧上升。因此，急需研制出一种快速、特异、敏感、高效的肠道病毒型特异性的检测方法用于早期诊断肠道病毒感染。
我们采用TaqMan技术成功地建立了肠道病毒荧光RT-PCR方法用于手足口病的病原。它具有特异性，能检测PolioⅠ、PolioⅡ、PolioⅢ、EV71、CA16、CA24等多个血清型别的肠道病毒，轮状病毒、诺如病毒均为阴性，无假阳性结果。灵敏度好，用质粒模板梯度稀释建立的标准曲线，线性好，R2=0.999。用TCID50建立灵敏度标准曲线，R2=0.99，曲线斜率为-3.381，PCR扩增效率为97.6%，本体系检测到的最低浓度为5.0TCID50/ml 。该方法用于临床标本检测，荧光RT-PCR检出率为80.9%，显著高于RT-PCR的62.92%。荧光RT-PCR显著高于RT-PCR。
本研究建立的快速鉴定肠道病毒的荧光定量RT-PCR方法，具有特异性强、敏感度高、效率高等优点，它操作简单，稳定性好，重现性好，可以在2h内快速高质量地对标本进行筛选。可以作为肠道病毒的快速检测方法用于临床早期诊断。
【参考文献】
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［6］Jed A. Fuhrman, Xiaolin Liang, and Rachel T. Noble. Rapid Detection of Enteroviruses in Small Volumes of Natural Waters by Real-Time Quantitative Reverse Transcriptase PCR［J］. Appl.Environ.Microbiol, 2005, 4523～4530.
作者单位：1.深圳市疾病预防控制中心,广东 深圳 518020; 2.华中科技大学同济医学院公卫学院环医所,湖北,武汉 430074.