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【摘要】 目的 体外克隆并表达梅毒螺旋体重复蛋白K，为制备预防性疫苗奠定基础。 方法 利用PCR反应及基因重组技术，扩增重复蛋白K编码基因，构建重组质粒pET28b㈩/TprK，IPTG诱导表达。 结果 PCR法扩增出了1350bp的目的片段，原核表达质粒pET28b㈩/TprK酶切鉴定正确，测序结果与Gengbank上公布的该基因序列完全一致，并可在大肠杆菌中高效表达。 结论 成功构建人pET28b㈩/TprK原核表达载体，并能高效表达TprK蛋白，为梅毒的预防性疫苗的制备以及进一步研究其血清学诊断试剂奠定了基础。
【关键词】 梅毒螺旋体；聚合酶链反应；重复蛋白K；基因克隆；基因表达
Cloning and expression of Treponema pallidum repeat protein K.
XIANG hua-guo, XIONG li-kuan, WANG Xiao-hong, et al.
(Department of laboratory, Shenzhen Municipal Fuyong Hospital, Shenzhen 518103, Guangdong, P. R. China)
Abstract: Objective To clone and in vitro express TprK and provide a good foundation for preparing prophylactic vaccine. Methods PCR and gene recombinant methods were used and the gene encoding TprK was amplified and inserted into expression vector pET28b㈩ after T-A cloning,. The recombinant plasmid was induced by IPTG to express TprK protein. Results The target gene at a length of 1350bp was amplified. Restriction map proved that recombinant plasmid pET28b㈩/TprK was correctly constructed. The sequence of target gene inserted into the recombinant plasmid was completely identical to that reported in GenBank, and efficiently expressed TprK protein in E. coli DH 5 . Conclusion Prokaryotic expression vector pET28b㈩ / TprK has been constructed successfully, and pET28b㈩ / TprK protein expressed to have set foundation for preparing prophylactic vaccine and developing serologically diagnostic kit for TP infection.
Key words: Treponema pallidum; Polymerase chain reaction; Gene clone; Gene expression
梅毒螺旋体重复蛋白K(Treponema pallidum repeat protein K,TprK)基因家族共有12个成员，以英文字母命名，从A到L，通过其氨基酸同源性分为Ⅰ(TprC, D, F, and I),Ⅱ(TprE, G, and J),和Ⅲ(TprA, B, H, K, and L)亚类，Ⅰ和Ⅱ亚类氨基端和羧基端均为保守序列，Ⅲ亚类由5个成员组成，与其他Tpr比较，同源性低。3个Tpr主要存在于梅毒螺旋体外膜，即2个Ⅰ亚类（TprF和TprI）、1个Ⅲ亚类（TprK）[1]。最近研究表明，TprK在感染期的Nichols株为调理素抗体靶位，诱导保护性免疫反应[2]。为此，本研究拟构建TprK表达载体，获得高效表达，为进一步研究梅毒基因预防性疫苗提供实验基础。现将结果报告如下。
1 材料和方法
1．1 材料 梅毒螺旋体Nichols株为新疆维吾尔自治区疾病控制中心董永慧主任技师惠赠，表达载体为pET28b㈩、 RosettaTM(DE3)plysS(Cam+)菌株、EcoliBL21(DE3)plysS和BL21TMstar(DE3)菌株为我们实验室保藏。质粒提取试剂盒、λDNA/HindIII Marker、BamHI、EcoRI、ExpandTM Taq聚合酶、dNTP 、T4 DNA Lagase、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖（X-gal）、 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）等为大连宝生生物技术公司产品。
1．2 方法
1．2．1 引物的设计与合成根据GenBank发表的TprK基因序列，设计一对引物如下：引物1：5-CATGGATCCCAGG-TTTCGTTCACCCCGGAT-3，引入BamHⅠ酶切位点；引物2:5-TCAGAATTCCTACCAAATCAAGCGACATGC-3，引入Hind Ⅲ酶切位点，由上海生工有限公司合成。
1．2．2 克隆表达载体目的基因TprK的扩增 PCR反应混合物100μl：Primer1和Primer2各5μl（10pmol/μl），2mM dNTP5μl，10×PCR buffer10μl，TP DNA10μl，Expand TMTaq酶2.5U(1μl)，无菌去离子水67μl，混匀后快速离心后，加入30μl无菌石蜡油。同时设置一个LP DNA阴性对照和不加TP DNA模板的空白对照管。反应条件：94℃4min，94℃30s, 45~65℃ 30s, 72℃2min, 30个循环，最后72℃延伸5min。
1．2．3 重组载体的构建 PCR产物的纯化见文献[3]。TprK基因与pET-22b载体双酶切：TprK基因与pET-p载体分别10μl、10×buffer H 2μl、NdeⅠ、SalⅠ各1μl 、无菌无离子水6μl，37℃5h。TprK基因与pET-p载体连接：TprK基因与pET-p载体回收产物17μl、分别17μl、10×T4Ligase buffer10μl，T4Ligase1μl（1U/μl）16℃ 5h。
1．2．4 重组体的转化 取4℃放置20h(或-80℃取出感受态细菌立即溶化后)保存管两支，立即放置冰浴中，取实验组（连结反应物）10μl和对照组（质粒40ng），分别加入200μl感受态细菌中，轻弹混匀后置于冰浴30min，取出置42℃热休克90S（不摇），取出后迅速放回冰浴中，将细菌冷却2min，加入800μlSOC培养基，37℃225r/min震摇培养90min，让细菌质粒表达抗生素抗性蛋白。
1．2．5 重组体转化菌DH5α筛选 取含氨苄青霉素100μg/L的SOB固体培养基(琼脂为1.5%)均匀涂布20ng/ml的X-gal40μl和200mg/ml的IPTG4μl，37℃放置2h左右，待溶液完全吸收，取200μl转化菌液，均匀涂布于平板表面，37℃培养30min后，倒置平板继续培养12h，以灭菌牙签随机挑取10个白色菌落，分别接种于5mlLB液体培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)中，37℃ 200r/min震摇培养过夜。
1．2．6 重组体转化菌PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定 重组体PCR鉴定酶切鉴定见目的基因TprK的扩增，酶切鉴定见TprK基因与pET-22b载体双酶切，重组体序列测定采用正向引物和反向引物测序，委托由上海生工有限公司完成。
1．2．7 重组体的表达与鉴定 取单个菌落接种于5mlLOC液体培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)中，37℃ 200r/min震摇培养过夜，再取50μl新鲜培养过夜菌液，加入5ml含氨苄青霉素100μg/ml另一LOC培养基中，37℃ 200r/min震摇培养3h至对数生长期，取1ml培养菌液作对照（未诱导），剩余的培养基中加入IPTG至终浓度为0．3mM后，37℃ 200r/min震摇培养，分别于1、2、3和4h收集培养菌液各1ml于离心管中。4℃rmp离心2min，弃上清，收集培养体经超声波破碎菌体后，于4℃1000rmp离心15min，分别取少量上清和沉淀加入等体积2×加样缓冲液，100℃煮沸5min，取15μl进行SDS-PAGE电泳检测表达产物。取诱导表达的大肠杆菌各30μg（湿重），加入90μl裂解液，0.24μl 50mmol/LPMSF和2.4μl溶菌酶(10mg/ml)，不时进行搅拌20min，再边搅拌边加入120μg去氧胆酸，置37℃并不时进行搅拌，至裂解液变粘稠时，加入0.61μl DNA酶I(1mg/ml)，置于室温直到裂解液不粘稠时，4℃ 12000g离心15min，去上清，沉淀重悬于9倍体积含0.5%TritionX-100和10mmol/LEDTA(pH8.0)的裂解液中，室温放置5min，再4℃12000g离心15min，吸出上清备用。再将沉淀重悬于20μl水中，-20℃保存备用。取上清和沉淀悬液各7.5μl加入7.5μl2×SDS加样缓冲液，100℃煮沸5min，取15μl SDS-PAGE电泳检测表达产物。
2 结果
2．1 目的基因的克隆和鉴定 将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在1300bp左右位置处可见一条清晰的特异性条带，与预期片段大小（1350bp）相符，将重组质粒pET28b㈩/TprK经BamHⅠ酶和Hind Ⅲ双酶切后得到2个片段，其大小分别约为5.4kb和1.35kb与预期一致（图1）。序列测定结果与基因库报到的序列完全一致（图2-3）。
图1：1: 重组质粒；2: 重组质粒双酶切；3: PCR产物大小约1350bp； 4: 阴性对照； 5: λDNA/HindIII Marker（略）
图2: pET28b㈩/TprK表达载体正向引物测序结果（略）
图3: pET28b㈩/TprK表达载体反向引物测序结果（略）
2．2 重组质粒蛋白SDA-PAGE分析 重组质粒 pET28b㈩/TprK在宿主菌E.coli DH5α中，经IPTG诱导表达出一分子量约为45KD的蛋白质，见图4。
图4：表达重组蛋白SDS-PAGE分析结果（略）
1：空宿主菌；2：重组质粒诱导表达菌；3：标准参照物
3 讨论
14世纪于欧洲最早发现性病梅毒，并很快传遍全世界。近10年来，全球梅毒的发病率均以不同程度上升，包括美国、前苏联等，我国也是如此，南方部分地区尤为突出。
梅毒螺旋体梅毒亚种为性病梅毒的病原体,其体外培养至今尚未成功，实验室诊断主要靠暗视野显微镜检查或血清学检查，但早期梅毒其敏感性不高。敏感性和特异性低的原因主要是由于体外培养不成功导致纯化抗原获得困难。
近年来，随着分子生物学技术的进展，利用DNA重组技术制备TP抗原的研究正在逐渐增多，无疑将为TP的实验室诊断，发病机理及疫苗研究带来新的前景。
TP的运动在梅毒发病机理中起着重要作用。研究表明内鞭毛为TP运动的细胞器，由蛋白质组成的外鞘包裹于中央核，主要成分为37、33.5、33KD多肽，内鞭毛 抗原可刺激人B和T淋巴细胞，在免疫病理中起着重要作用[4]。研究表明17KD脂蛋白可刺激巨噬细胞产生肿瘤坏死因子（TNF-α）。此外，17KD脂蛋白也是一种很强的免疫原，感染TP后一周内即可产生17KD抗体。本研究用PCR扩增TprK基因，并进行克隆表达，为进一步纯化抗原用于实验室诊断和疫苗的研制打下了良好的基础。
【参考文献】
［1］ Leader, BT, Hevner K, Molini BL,et al. Antibody responses elicited against the Treponema pallidum repeat proteins differ during infection with different isolates of Treponema pallidum subsp. pallidum. Infect. Immun, 2003，71(10)：6054~6057.
［2］ Centurion-Lara A, Gordones C, Castro C，et al. The tprK gene is heterogeneous among Treponema pallidum strains and has multiple alleles. Infect. Immun，2000，68(2)：824~831
［3］ 萨姆布鲁克 J， 费里奇 EF， 曼尼阿蒂斯 T. 著. 分子克隆实验指南. 金冬雁， 黎孟枫. 译. 第2版. 北京：科学出版社，1999.888~897.
［4］ Giacani L,Molini B, Godornes C,et al,Quantitative Analysis of tpr Gene expression in Treponema pallidum Isolates：Differences among isolates and correlation with T-Cell responsiveness in experimental syphilis，Infect. Immun, 2007，75(1)：104~112
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