恶性疟原虫对青蒿素类药物抗药性的研究进展

【摘要】  　　恶性疟是一种致死性很高的全球性寄生虫病。长期抗疟治疗引起恶性疟原虫对氯喹等主要抗疟药物普遍产生抗药性，青蒿素类药物是在氯喹抗药性产生之后的主要替代治疗药，也是至今唯一没有出现普遍抗药性的抗疟药，但有研究提示青蒿素类药物的敏感性正逐渐下降，抗性产生是不可避免的。为有效预防和控制恶性疟对青蒿素类药物抗药性的产生及传播，对其抗性机制研究迫在眉睫。目前的研究发现，除pfatp6,tctp等，疟原虫的电子传递链也可能是青蒿素类药物的作用靶点,而恶性疟原虫对其抗药性的产生可能与pfmdr1, pfcrt, pfatp6，tctp,cg10等基因及其突变有关，但至今尚未明确真正的抗性相关基因。

【关键词】  恶性疟；青蒿素；抗药性；基因

　　疟疾是严重危害人类健康的全球性传染病之一，世界上超过40％的人生活在疟疾疫区，每年有5亿多人感染, 超过100万人死于疟疾，90％的疟疾导致的死亡发生在非洲，死亡的儿童中约五分之一死于这种疾病[1]。恶性疟发病症状凶险，愈后极差，其病死率可高达50％。云南的调查表明，以恶性疟为主的重症疟疾，近20％病人死亡，且以中青年为主，危害严重，恶性疟点状爆发流行时有发生[2]。
   
　　自60年代以来，恶性疟原虫对主要抗疟药氯喹产生抗药性，并在全球范围内由单一抗药性向多药抗药性发展。恶性疟原虫抗药株的出现已形成有效控制的严重问题，给疟疾防治带来新的挑战，抗性研究迫在眉睫。本文就恶性疟原虫对青蒿素及其衍生物抗性相关基因方面的研究进展作一综述。

　　1  青蒿素类药物概况
　　
　　青蒿素（Artemisinin）及其衍生物双氢青蒿素（Dihydroartemisinin），青蒿琥酯（Artesunate），蒿甲醚（Artemether），蒿乙醚（Arteether）是一类全新结构的抗疟药，又名黄花蒿素，是中国医药学工作者1971年从菊科植物黄花蒿叶中提取分离得到的，是目前世界上最有效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟的药物，在那些疟原虫已经对多种药物产生抗性的地区，青蒿素类药物依然能够在几天内治愈超过90％的疟疾患者[3]。

　　1.1  抗疟作用特点  青蒿素及其衍生物的抗疟作用具有迅速，高效，低毒，安全且与多数抗疟药无交叉抗性等特点，对各种疟疾有效，比其他抗疟药能更快地缓解临床症状，清除血中原虫，对间日疟或恶性疟以及抗氯喹虫株的红内期有杀灭作用。青蒿素类药物对原虫的早期裂殖体作用迅速，青蒿素还具有独特的杀灭疟原虫配子体的作用，其作用的强度和剂量与配子体成熟度相关[4]。因而青蒿素类药物能控制传染源，减少传播，对控制疟疾流行十分有利。

　　1.2  抗疟作用机理、毒理　　青蒿素主要抗疟作用和毒性机理是分子中的抗疟活性部分过氧桥。其次还通过影响营养物质转运、抑制血红蛋白酶、破坏血红素解毒机制、烷化DNA等多种途径产生抗疟作用。

　　1.2.1  抗疟作用机理  形态学研究普遍显示，青蒿素类药物选择性作用于疟原虫的膜系结构，破坏其食物泡膜，线粒体膜及核膜、质膜，影响表膜－线粒体的功能，阻断疟原虫的营养供应；也影响原虫的糖代谢和蛋白质代谢，对原虫的呼吸能产生明显抑制作用；还可使核内染色质形成自噬泡而导致虫体瓦解[5]。
  　　
　　近年的研究在分子和基因水平上进一步阐明其抗疟作用机制。实验显示青蒿素的抗疟活性与不同氧压力有关，随氧压力增高青蒿素对体外培养的恶性疟原虫的半数有效浓度(ED50)降低。活性氧既可直接作用于疟原虫, 也可使红细胞损伤、破溶而导致疟原虫死亡。阿霉素、维生素B2及甲萘醌等自由基引发剂与青蒿琥酯具有协同抗疟作用, 而自由基清除剂如维生素E、维生素C、谷胱甘肽及二硫苏糖醇等则能降低青蒿素的抗疟作用[6]。此外，青蒿素能使疟原虫对异亮氨酸的摄入量明显减少，对虫体蛋白质的合成有抑制作用[6]。Kannan等[7]认为青蒿素类药物通过抢夺疟原虫血红蛋白使血红素减少，与疟原虫组氨酸蛋白结合减少导致疟色素大量减少或不能合成，引起抗氧化能力下降。
  　　
　　Eckstein-Ludwig等[8]提出青蒿素类药物作用机制是由于抑制了疟原虫内质网钙ATP酶的活性，并通过荧光实验证明肌浆与内质网的Ca2＋－ATP酶（Plasmodium falciparum Ca2＋－ATPase pfatpase6）很可能是青蒿素类药物的作用靶点。Krishna等提出，青蒿素类药物能够抑制在爪蟾卵中表达的pfatp6酶的活性，也可能抑制恶性疟原虫pfatp6酶，因为它的某些化学结构与毒胡萝卜素很相似[8,9]。Eckstein-Ludwig等证实青蒿素能完全抑制pfatp6酶的活性，在不影响其它正常细胞Ca2＋排出的情况下，通过与pfatp6酶结合而阻断疟原虫所在细胞 pfatp6酶的活性，不能将Ca2＋排出细胞以调节Ca2＋水平，导致细胞内Ca2＋水平升高，从而引起细胞凋亡，发挥治疗疟疾的作用。Krishna等还提出恶性疟原虫的电子传递链可能是青蒿素作用的新靶标[9]。当酵母在不可发酵的培养基中生长时，青蒿素的敏感性随IC50值从80nM减少到10nM而成倍数增加。青蒿素使线粒体膜去极化，抑制酵母在不发酵的培养基中生长。

　　1.2.2  毒理  青蒿素类药物的毒副作用很低，安全范围较大，无严重的不良反应。Kissinger等研究表明青蒿素及其衍生物有以中枢神经系统为主的神经毒性等副作用[10]。体外试验中，青蒿素对神经元细胞有毒性作用，机制可能与青蒿素抗疟作用机制相似。青蒿素类药物存在对三个月以内的早期胚胎有致畸的可能性。在小鼠、大鼠、以及家兔的特殊毒性试验中证实，青蒿素类药物有明显的胚胎毒作用。万红平等[11]在研究青蒿素对大鼠致畸作用时观察到，青蒿素对SD大鼠有胚胎毒性及较弱的致畸作用，延迟胎仔的发育，主要对骨骼尤其短多肋的发育有一定影响。赵丽等[12]应用青蒿琥酯片治疗50例早期妊娠疟疾患者，临床观察可造成早孕流产，但病例追踪产后没有发现先天性畸形新生儿。

　　2  青蒿素类药物的抗药性

　　2.1  抗药性现状　　随着恶性疟原虫氯喹抗性株在全球范围内的扩散，青蒿素及其衍生物作为高效速效的抗疟药，大量广泛连续临床使用，致使恶性疟原虫对青蒿素的抗药性正在快速发生和发展。尽管青蒿素类药物治疗恶性疟有很好疗效，但20世纪早期在泰国，印度和塞拉利昂有临床疑似青蒿素抗性病例报道[13~15]，2006年在Grench Guiana和塞内加尔也报道发生恶性疟原虫对青蒿素类药物产生抗性。中国也如此，杨沧江[16]2000年报道云南发现1例恶性疟对蒿甲醚抗性病例；2001年苏林光等[17]报道海南抗蒿甲醚恶性疟2例。经过20多年青蒿素类药物敏感性监测，证实青蒿素类药物的敏感性正在明显下降。杨恒林等[18,19]应用Rieckmann体外微量测定云南恶性疟原虫对氯喹、咯萘啶及青蒿琥酯的敏感性，显示云南恶性疟原虫对青蒿琥酯的敏感性降低，当然，大部分对青蒿素类药物敏感,只有小部分恶性疟原虫已产生了低度抗性，同时提示抗青蒿琥酯恶性疟原虫对同类药及咯萘啶有交叉抗性的可能，抗咯萘啶、抗青蒿琥酯恶性疟原虫对氯喹似无交叉抗性。

　　2.2  抗药性影响因素　　抗药性问题通常是由多种因素引起的。治疗方案的不完整、不规范所导致的不合理用药是产生抗药性的严重危险因素。比如, 抗疟药大量使用；经常采用单一疗法；依次使用各种抗疟药物；尽管抗药性高到难以接受的水平却仍继续使用的状况得不到控制等。另外, 过分依赖喹啉类化合物和抗叶酸盐药物可导致在这些药物之间形成交叉抗药。这些因素都促使恶性疟对青蒿素等抗疟药产生抗药性。
  　　
　　除此以外，抗性的形成还部分依赖于药物动力学的药效学特性，与药物半衰期有关。长半衰期抗疟药特别容易发生抗药性，而半衰期短的抗疟药因疟原虫不可能暴露在低于治疗浓度的药物压力下达足够长时间，而易形成抗药性。青蒿素及其衍生物半衰期较短，药物作用消失较快，作用高效迅速，同时其对配子体有活性，致使经青蒿素类药物治疗后的病人传播疟原虫的可能性大大降低。若单用青蒿素类药物治疗少于5d，约有50％病人原虫血症消除短暂，再燃率较高。此外，较高的复燃率就意味着抗药性培育，会促进疟原虫产生抗药性。

　　2.3  延缓抗药性产生的对策  近年来，疟疾的发病率和病死率呈上升趋势，死亡人数每年已超过100万，其上升的主要原因之一为恶性疟原虫株对一些常规抗疟药如氯喹、甲氟喹、奎宁及磺胺多辛／乙胺嘧啶产生了抗药性。多重抗药的恶性疟疾已在东南亚和南美洲等地广泛流行。因此，WHO于2006年1月19日发出通知，要求停止生产、销售单一青蒿素制剂或使用青蒿素单一疗法治疗疟疾，以防止疟原虫产生抗药性，并将治疗疟疾的指导原则改为主要采用青蒿素联合疗法[20]。
   
　　联合疗法是利用不同作用靶点的抗疟药，使疟原虫的不同代谢环节受到药物的干扰，以缩短疗程增加疗效，避免低血药浓度的出现，延长药物的寿命，延缓抗药性的产生。实践证明，青蒿素与甲氟喹联合使用，治疗多药抗性恶性疟原虫感染效果比较可靠，抗甲氟喹虫株对青蒿素也不太敏感，可能与两种药物有协同作用有关。在泰国[21]研究发现青蒿琥酯和甲氟喹联合使用能延缓抗甲氟喹的抗性的产生，还能减少严重抗甲氟喹地区的疟疾传播。原因之一，联合用药治愈率高，产生抗性突变的选择压力减少；其二，青蒿琥酯降低了配子体血症密度，减少传播，减轻了抗性扩散的选择压力。多项研究证实，青蒿素与其它抗疟药联合应用能有效预防和延缓抗药性的产生，并且降低原虫复燃率。

　　2.4  抗药性机理及相关基因  关于青蒿素抗性的形成机制有多方面的研究。通常抗疟药抗性的产生可能有两个机制：一是药物分布的改变，多是药物排出增加；二是药物作用靶点敏感性发生变化。以异硫氰酸荧光素－伴刀豆球蛋白A（F-Con A）为探针，采用显微分光光度技术，对抗青蒿酯钠伯氏疟原虫滋养体膜面的Con A结合位点结合量进行测定，并与其伯氏疟原虫敏感株进行比较，提示膜流动性的改变是膜表面位点结合量Con A改变的原因之一[22]。通过遗传学研究证实，电子传递链在青蒿素抗疟机制中发挥重要作用。电子传递链能激活青蒿素的作用，青蒿素的抗性产生主要通过电子传递链之间相互作用引起膜电势下降抑制线粒体功能来介导，其后产生的自由基进一步破坏线粒体。编码线粒体NADH脱氢酶的NDE1或NDI1缺失能引起青蒿素产生抗性，而过度表达则增加敏感性[23]。影响电子传递的突变和环境因素也改变宿主对青蒿素的敏感性。
   
　　目前实验室培育出了抗青蒿素的恶性疟原虫和约氏疟原虫虫株，但抗性都不太稳定，而且抗性指数不高，与药物压力变化密切相关，一旦撤销药物压力，抗药株就会恢复敏感[24]。
   
　　因此认为疟原虫对青蒿素抗药性是药物压力下相应基因表达改变，从而引起作用靶点蛋白的表达量改变的结果。研究证实恶性疟对青蒿素产生抗性后，会提高对氯喹的敏感性，提示青蒿素抗性与氯喹抗性有密切关联。
   
　　抗药性基因标记物的检测可用于药物分布和靶标敏感性的监测，为抗性机制的研究提供依据。为深入探讨青蒿素抗性机理，许多研究在基因水平上进行探讨，目前提出有关人体恶性疟原虫青蒿素抗性的可能的相关基因，如pfmdr1,pfcrt,pfatp6，tctp,cg10等。
  　　
　　大量研究显示，其它抗疟药耐药性相关基因的遗传突变对青蒿素及其衍生物的体外敏感性有影响。恶性疟原虫多药耐药性基因（Plasmodium falciparum multidrug resistance gene，pfmdr1）和恶性疟原虫氯喹耐药性转运蛋白基因（Plasmodium falciparum chloroquine resistant transporter ，pfcrt）与抗疟药耐药性产生密切相关， pfmdr1基因突变和pfmdr1拷贝数增加与包括喹啉和青蒿素在内的许多抗疟药的抗性产生有关。引起甲氟喹敏感性降低的pfmdr1的突变导致对青蒿素衍生物的敏感性升高[25]，pfcrt蛋白76 位点的突变降低对氯喹的敏感性而升高对青蒿素的敏感性[26]。
　　
　　粘附糖蛋白Pgh1是一种多药抗性蛋白，可能受pfmdr1和pfcrt及染色体基因（Chromosome gene cg）cg2 基因的调控，它的S1034C,N1042D和D1246Y三个位点的突变能够把青蒿素的敏感性提高两倍[25]。
  　　
　　另外，编码青蒿素类药物的潜在作用靶点－恶性疟肌浆和内质网Ca2＋－ATP酶（pfatp6）和恶性疟翻译控制肿瘤蛋白(tctp)的基因突变会改变恶性疟原虫对青蒿素的敏感性，pfatp6基因中的单核苷酸多态性（Single-nucleotide polymorphisms SNPs）尤其769位点的多态性与疟原虫的体外青蒿素敏感性降低有关 [27]。Menegon等[28]对来自不同国家的75个样本pfatp6酶的多态性进行SNP检测发现，SNP在431位点密码子由E→K占18.6％，在243位点由H→Y和623位点由A→E仅出现一次，在所有被检测样本中263和769位点均未发现基因多态性。序列分析也表明 L402V,K771E,A630S,N683K和 K776N 的多态性并未得到证实，这些SNPs只分别在12(16%),3(4%),1,1和1个样本中出现。该研究还证实了243Y和431K/623E位点存在突变现象。这些研究仅能观察pfatp6酶的多态现象，还不能证实是自然存在的或是在药物作用下产生的。Dahlstrom[29]等用大量不同地理株的临床样本进一步揭示pfatp6的多态性，发现与先前的诸多研究有很大不同，在桑尼巴和坦桑尼亚地理株存在三个新位点E431K,N569K和A630S的高频突变，这三个基因位点有巨大差异，此种天然变异可能是疟原虫产生青蒿素抗性的基础。而263位点和769位点可能与青蒿素体外敏感性降低有关，Krishna等[9]实验表明S769N的序列置换与蒿甲醚的IC50值的升高有关，IC50 的中位值是79.4nM(37.2-109.3nM)。
  　　
　　目前，青蒿素抗性相关基因的研究在鼠疟方面比较多。为研究疟原虫的抗药性，国内外已培育出许多青蒿素抗药性虫株，尤其是鼠疟原虫。陈颖丹[30]等利用鼠疟模型，采用伯氏疟原虫抗青蒿素虫株研究显示，伯氏疟原虫青蒿素抗性与多药抗性基因pbmdr1无明显关系。Ferrer-Rodriguez[31]等通过逆转录聚合酶链反应和Western印迹法证实，约氏疟原虫mdr1基因（pymdr1）存在抗青蒿素序列。用含不同抗药性的约氏疟原虫长序列重复片段观察疟原虫抗药性机制发现，在约氏疟原虫抗青蒿素基因序列中Pymdr1基因拷贝数增加2或3倍。Hunt[32]等研究发现，抗青蒿琥酯及抗氯喹鼠疟原虫编码泛素分解酶（Deubiquitinating）的基因发生了突变。翻译控制肿瘤蛋白(tctp)是一个受翻译过程所阻遏并与肿瘤生长相关的蛋白质，认为它可能是青蒿素类药物的受体蛋白之一。Walker等[33]研究青蒿素在约氏鼠疟原虫的抗性机制时并没有发现敏感株与抗性株之间tctp基因序列的差异，而抗性株tctp蛋白的表达量却是敏感株的2.5倍。
  　　
　　最值得关注的是Afonso等[34]首次报道，利用药物压力的作用，从夏氏鼠疟原虫已克隆化的青蒿素与青蒿琥酯敏感系中筛选出具有稳定遗传性且能经蚊体稳定传代的青蒿素与青蒿琥酯抗药株，将其与敏感株进行比较，上述pfmdr1,tctp,cg10,atp6等与青蒿素抗性相关的候选基因既无遗传突变，也无基因拷贝数目的增加。因此以上青蒿素抗性相关基因与疟原虫产生青蒿素抗性的关系还有待进一步研究。

　　3  结语
　　　　
　　抗青蒿素病例报告不多，但人类疟原虫对青蒿素类抗疟药抗性的产生是不可避免的趋势，在分子水平尤其基因水平对其抗药性的深入研究是揭示其抗性机理和有效预防的必要措施。
   
　　鼠疟抗青蒿素株已经发生，可以为人疟可能发生的几种抗性提供线索。相信通过培育出人体外恶性疟原虫青蒿素抗性单克隆株，对疟疾青蒿素抗性的研究会出现突破性进展。

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