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【摘要】 目的：探讨氧自由基及一氧化氮在内毒素介导的豚鼠耳蜗损伤中的作用。方法：选用耳廓反射灵敏的豚鼠36只,随机分为I组：正常对照组（12只）；Ⅱ组：生活盐水对照组（12只），双侧听泡各灌注50 μl生理盐水；Ⅲ组：内毒素组（12只），双侧听泡各灌注50 μl LPS (1μg/μl) 。所有动物测试听性脑干反应测听（ABR），并测定耳蜗组织中超氧化物歧化酶（ SOD）活力，和耳蜗组织中一氧化氮（NO）含量，同时观察耳蜗组织形态学变化。结果：内毒素组ABRⅠ波、Ⅱ波潜伏期及阈值较其余各组有增大趋势。内毒素组耳蜗组织中SOD活力较其余各组降低 （P<0.05），NO含量较其余各组升高（P<0.05）。内毒素组耳蜗底转内、外毛细胞纤毛出现明显的倒伏、排列紊乱，外毛细胞纤毛损伤从内排到外排逐渐加重，并可见内、外毛细胞纤毛缺失。结论：内毒素导致耳蜗组织中超氧阴离子及NO的大量生成可能是其引起耳蜗组织损伤的部分机制。
【关键词 】 内毒素；超氧化物歧酶；一氧化氮；中耳炎
Effect of oxygen free radicals and no on the pathological injury of guinea pig cochlea induced by endotoxin.
LI Xiao-ping， WANG Xiao-hong，ZHAO Yu-lin
(Department of the first Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Henan 450052, China)
【Abstract】 Objective：The aims of this experiment are to study the Effect of Oxygen free radicals and NO on the Cochlea of Guinea Pig. Methods:Thirty-six healthy guinea pigs were randomly divided into 3 groups. GroupⅠ(n=12), the normal control group. Group Ⅱ(n=12), the saline control group. 50μl sterile saline was instilled into each tympanic cavity. Group Ⅲ (n=12), the endotoxin group. 50μl of 1μg/μl solution of LPS was instilled into each tympanic cavity. Inner ear function of the all guinea pigs was assessed by auditory brainstem response ardiometry (ABR). Three of the guinea pigs were used to measure the activities of superoxide dismutase (SOD) in cochlear and five of the guinea pigs were used to measure the concentrations of nitric oxide (NO) in cochlear and two guinea pigs were used to observe morphology features by scanning electron microscope.Results: In group Ⅲ ，the latencies and thresholds ofⅠwave, Ⅱ wave ， the ABR threshold had elevatory tendencies compared with those in other groups (P<0.05). The activities of SOD showed a statistically significant decrease (P<0.05) and the concentrations of NO showed a statistically significant increase in group Ⅲ compared with those in other groups (P<0.05). In group Ⅲ， basal cochlear turn showed disarrangement of inner hair cell stereocilia and outer hair cell stereocilia and loss of hair cells.Conclusions: The enhanced contents of both superoxide anion （O ） and nitric oxide (NO) may be part of the mechanism of the pathological injury of the cochlear induced by endotoxin.
【Key words】Endotoxin; Superoxide dismutase; Nitric oxide; Otitis media
内毒素是存在于革兰氏阴性菌细胞壁中以脂多糖 (Lipopolysaccharide，LPS)为主的成分，具有毒性作用。本实验采用LPS建立中耳炎时内耳损伤的模型，检测耳蜗组织中超氧化物歧化酶（SOD）活力和测定耳蜗组织中一氧化化氮（NO）含量，探讨氧自由基（oxygen free radicals,OFR）及NO在内毒素介导的豚鼠耳蜗损伤中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组
选用耳廓反射灵敏的健康豚鼠36只,体重250~350克，雌雄不限（由郑州大学实验动物中心提供），将上述动物随机分为以下三组：I组：正常对照组，12只，每只动物ABR测试后快速断头，5只（10耳）用于测定耳蜗组织中SOD活力，5只（10耳）用于测定耳蜗组织中NO含量，2只（4耳）用于耳蜗组织形态学观察。Ⅱ组：生理盐水对照组，12只，双侧听泡各灌注50 μl生理盐水， 48小时后，每只动物ABR测试后快速断头，5只（10耳）用于测定耳蜗组织中SOD活力，5只（10耳）用于测定耳蜗组织中NO含量，2只（4耳）用于耳蜗组织形态学观察。Ⅲ组：内毒素组，12只，双侧听泡各灌注50 μl LPS (1μg/μl)，48小时后，每只动物ABR测试后快速断头，5只（10耳）用于测定耳蜗组织中SOD活力，5只（10耳）用于测定耳蜗组织中NO含量，2只（4耳）用于耳蜗组织形态学观察。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型的建立
用本实验室建立的听泡内接种内毒素的方法来建立中耳炎模型。
1.2.2 ABR测试
(1)将豚鼠采用10%水合氯醛（200~300 mg/kg体重）全身麻醉后置于隔音电屏蔽室中，短声刺激强度从90 dBSPL开始，测试豚鼠两耳的阈值，I~IV各波潜伏期及Ⅰ~Ⅲ波间期。以70 dBSPL刺激强度所得出各测试参量进行统计学分析。各数据资料及图形由测试系统自身的PC-286微机自动读取。
1.2.3 耳蜗组织中SOD活力测试
豚鼠全麻后快速断头处死，于冰生理盐水中取出耳蜗，电子天平称重，在冰浴下以0.9%冷生理盐水为介质制成2%匀浆组织，按试剂盒说明书配液，用旋涡混匀器充分混匀，37 ℃恒温水浴40分钟，加显色剂后混匀，静置10分钟后用721分光光度计测定，波长550 nm处比色测各管吸光度值。
1.2.4 耳蜗组织中NO含量测定
豚鼠全麻后快速断头处死，于冰生理盐水中取出耳蜗，电子天平称重，在冰浴下以0.9%冷生理盐水为介质制成10%匀浆组织，按试剂盒说明书配液，用旋涡混匀器充分混匀，置37 ℃恒温水浴60分钟，再按说明书加液后混匀30秒，室温静置10分钟，低温下离心1000 r/min，共5分钟，取上清，加显色剂后混匀，静置10分钟，用U-2001型紫外可见分光光度仪测定，波长550 nm处比色测各管吸光度值。
1.3 制作耳蜗扫描电镜标本
1.4 统计学处理
用SPSS 10.0软件处理数据，采用单因素方差分析，应用LSD法。以P<0.05为差异有显著性的检验标准。
2 结果
2.1 ABR测定
结果见表1、2。Ⅰ波潜伏期、Ⅱ波潜伏期及阈值：各组之间差异无显著性，内毒素组较其余各组有增大趋势。Ⅲ波潜伏期：内毒素组较其余各组延长(P<0.05)。Ⅲ波潜伏期和Ⅰ~Ⅱ波间期：内毒素组较各对照组延长(P<0.05)。
表1 ABR结果（略）
*：组间比较 P<0.05;**:组间比较P<0.01。
表2 ABR阈值结果（略）
统计方法与上表同。各组之间差异无显著性。
2.2 耳蜗组织SOD活力及NO含量测定
结果见表3。正常对照组、生理盐水对照组耳蜗组织中SOD活力及NO含量差异均无显著性；内毒素组耳蜗组织中SOD活力较其余各组降低（P<0.05），NO含量较其余各组升高（P<0.05）。
表3 各组动物耳蜗组织SOD 、NO测定（略）
** 组间比较P<0.01。
2.3 扫描电镜观察
正常对照组、生理盐水对照组耳蜗底转内、外毛细胞纤毛排列相对整齐；内毒素组耳蜗底转内、外毛细胞纤毛出现明显的倒伏、排列紊乱，外毛细胞纤毛损伤从内排到外排逐渐加重，并可见内、外毛细胞纤毛缺失。
3 讨论
3.1 LPS介导的中耳炎中内耳损伤的机制探讨
3.1.1 内耳损伤与OFR的关系
LPS导致的OFR生成增多可能与LPS作用、组织缺血缺氧及机体清除功能下降等因素有关，并通过黄嘌呤氧化酶途径、线粒体呼吸链途径、吞噬细胞的呼吸爆发途径、花生四烯酸代谢途径和OFR清除系统障碍等使各类OFR产生增多，OFR可造成细胞膜的损伤，进一步造成组织的损伤。
Parks等［1］在中耳炎豚鼠模型中发现感染的中耳黏膜组织中SOD活性明显低于对照组，认为O 2-参与了中耳黏膜的损伤过程。本实验结果内毒素组耳蜗组织中SOD活力低于各对照组，说明LPS导致了O2-生成增多。O2-是OFR的一种类型，由激活的中性粒细胞和单核细胞释放，能对生物机体造成一系列的氧化损伤，如攻击多聚不饱和脂肪酸引起脂质过氧化反应使生物膜结构、功能及细胞膜表面受体改变；损伤蛋白质的巯基和氨基使蛋白质变性、交联、酶的活性丧失；损伤DNA导致DNA链断裂及突变。耳蜗具有自己的抗氧化防御系统，主要存在于Corti器和血管纹［2］。SOD即是此防御系统的一员，它对O2-有专一性的抑制作用，能将其灭活并转化成水和氧气，使组织免受O2-和ONOO- 的损害。本实验中内毒素组耳蜗组织形态学观察结果耳蜗底转内、外毛细胞纤毛出现明显的倒伏、脱落、排列紊乱，并可见内、外毛细胞纤毛缺失。综上分析内毒素组耳蜗组织中SOD活力的下降表明LPS介导的O2-可能参与耳蜗的病理损伤过程，而OFR则可通过耳蜗的窗膜进入内耳，造成内耳毛细胞的结构和功能的损伤。
3.1.2 内耳损伤与NO的关系
有研究表明，NO产物的增加可能是导致耳蜗病理性损伤的一个主要因素［3-5］。实验证实［6］，在内耳中灌注LPS后，发现了诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的大量表达，表明伴有NO的大量生成。另外，Hess等［3］将LPS注入豚鼠中耳腔，6小时后在螺旋韧带、螺旋器的支持细胞、螺旋神经节核及神经纤维中探测到iNOS的表达，并认为iNOS诱导的NO的大量生成参与了LPS导致的内耳损伤。本实验结果支持这一理论,内毒素组耳蜗组织中NO含量高于各对照组,表明LPS能诱导NO的大量生成。 NO既是一种信使分子，又是一种毒性分子［7］。当生成量适合时，它在多种生理过程中作为关键性信号分子发挥作用；而另一方面，过量的未加控制的NO合成可能引发或加速某些致命的或致衰弱性的病理生理过程的发展。过量的NO可与铁反应,形成铁-硝基复合物参与巨噬细胞毒性作用；能与谷胱甘肽结合，影响氧化物产量和葡萄糖代谢；能通过NO依赖性的二磷酸腺苷-核糖化,降低了胞内能量储存；还可与O2反应形成ONOO- 产生细胞毒性作用，造成组织损伤、细胞坏死。本实验结果表明，LPS诱导的NO的大量生成，而NO通过耳蜗的窗膜进入内耳，参与了内耳的病理过程，导致了耳蜗组织形态学及耳蜗毛细胞功能的损伤。本实验表明，OFR及NO的大量生成对耳蜗毛细胞的损害可能是内毒素引起耳蜗损伤的部分机制。
参考文献
［1］ Parks RR, Huang CC, Haddad J Jr. Superoxide dismutase in an animal model of otitis media［J］. Eur Arch Otorhinolaryngol, 1995,252（2）:153-158.
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［3］ Hess A, Bloch W, Huverstuhl J, et al. Exptession of inducible nitric oxide synthase(iNOS/NOSⅡ)in the cochlea of guinea pigs after intratympanical endotoxintreatment［J］.Brain Res,1999,830（2）:113-122.
［4］ Amaee FR, Comis SD, Osborne MP. NG-methyl-L-arginine protects the guinea pig cochlea from the cytotoxic effects of pneumolysin［J］. Acta Otolaryngol(Stockh),1995,115（4）: 386-391.
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［6］ Takumida M, Popa R, Anniko M. Lipopolysaccharide-induced expression of reactive oxygen species and peroxynitrite in the guinea pig vestibular organ［J］. ORL,1998,60（3）:254-262.
［7］ Kooy N M, Royall J A, et al. Evidence for in vivo peroxynitrite production in human acute lung injury［J］. Am J Respir Crit Med, 1995,151(4):1250-1254.
基金项目：河南省优秀中青年骨干教师资助课题（2001006）
（河南省郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450052）