点击显示 收起
许多感音神经性聋与免疫因素有关，部分突聋、梅尼埃病、耳硬化症、慢性中耳炎、颞骨创伤，以及一些伴发听力丧失的全身免疫性疾病都存在内耳免疫损伤因素。为了探讨Ⅱ型胶原（type Ⅱcollagen,CⅡ）在自身免疫性内耳病（autoimmune inner ear disease,AIED）AIED发病中所起的作用，本实验用鸡Ⅱ型胶原建立豚鼠自身免疫性内耳病模型，用免疫组织化学技术观察模型建立初期细胞间粘附因子-1（intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1）的表达情况，并从功能、形态方面评价动物模型的内耳损伤情况。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
选用耳廓反射灵敏，体重150~200克纯白红目豚鼠65只，雌雄不限，随机分为以下三组：Ⅰ组：对照组（10只，20耳），不施加任何因素，与Ⅲ组相同时间点各处死5只；Ⅱ组：佐剂组（15只，死亡1只，28耳），首次皮下注射完全弗氏佐剂（complete Freundadjuvant,CFA）0.1 ml，以后每周皮下注射1次0.1 ml不完全弗氏佐剂（incomplete Freundadjuvant，IFA），共注射6次，分别于末次注射后第3天和2周各处死7只；Ⅲ组：实验组（40只，死亡3只），首次皮下注射鸡Ⅱ型胶原(400 μg)与CFA的乳浊液0.1ml，以后每周皮下注射1次鸡Ⅱ型胶原(200μg)与IFA的乳浊液0.1 ml，共注射6次，末次注射后3天和2周分别处死19只、18只。各组动物均在处死前测定ABR。
1.2 脑干诱发电位测试及内耳扫描电镜观察
测试每只豚鼠两耳的ABR阈值、各波潜伏期及Ⅰ~Ⅲ波波间期，以70 dBSPL刺激强度所得出的各测试参量进行统计学分析。处死后Ⅰ组和Ⅱ组均用2只（4耳）作扫描电镜观察，Ⅲ组用5只（10耳）作扫描电镜观察。
1.3 免疫组织化学检测及数据统计分析
剩余动物内耳作石蜡包块供免疫组织化学检测ICAM-1的表达以及HE染色观察。实验数据用SPSS 10.0软件处理。
2 实验结果
2.1 ABR测试结果 各波潜伏期及Ⅰ~Ⅲ波波间期，在Ⅰ组和Ⅱ组之间差异无显著性（P>0.05），Ⅲ组较Ⅰ组和Ⅱ组有延长（P<0.05），Ⅲ组2周较3天时有延长（P<0.05）。听觉阈值：Ⅰ组和Ⅱ组之间差异无显著性（P>0.05），Ⅲ组较Ⅰ组和Ⅱ组有升高（P<0.05），Ⅲ组2周时较3天时有升高（P<0.05）。Ⅲ组3天38耳中8耳出现听力阈值升高，范围在10 dB左右，部分阈值无升高耳各波潜伏期及Ⅰ~Ⅲ波波间期也有延长。2周36耳中有13耳出现听力阈值升高，听损率为36.11%，范围在10 dB~30 dB之间。
2.2 扫描电镜观察结果 Ⅰ组和Ⅱ组的内毛细胞和外毛细胞听毛排列整齐，无缺失；Ⅲ组3天时第三排外毛细胞部分听毛缺失和倒伏，第一、二排不明显；Ⅲ组2周时第三排外毛细胞听毛出现倒伏、部分听毛呈簇状缺失或完全缺失，第一和第二排外毛细胞听毛有轻微的倒伏，无缺失现象。
2.3 免疫组织化学结果 Ⅰ组和Ⅱ组耳蜗组织ICAM-1表达为阴性；Ⅲ组螺旋神经节细胞、神经纤维、血管纹、基底膜和血管内皮细胞等部位均有ICAM-1表达；Ⅲ组2周较3天时ICAM-1表达明显下降。经统计学检验：Ⅰ组和Ⅱ组之间差异无显著性（P>0.05）；Ⅲ组与Ⅰ组和Ⅱ组之间均有显著性差异（P<0.05）；Ⅲ组2周与3天之间有显著性差异（P<0.05）。
3 讨论
3.1 Ⅱ型胶原与AIED
胶原是结缔组织的主要蛋白成分，分布于骨组织、神经的束膜、纤维组织等。Ⅱ型胶原主要分布于耳蜗的内软骨层、蜗轴的筛状板、蜗螺旋管、螺旋韧带、椭圆囊斑、球囊斑、半规管膜、壶腹嵴和内淋巴管的上皮连接组织［1］。国内学者张学渊［2］等用酶标抗体间接染色法研究发现，豚鼠耳蜗组织中Ⅱ型胶原分布于耳蜗螺旋韧带、基底膜、螺旋缘、盖膜和螺旋神经节周围；并证实耳蜗组织中无Ⅰ型和Ⅲ型胶原存在。本研究采用皮下注射的方法，直接把外来抗原暴露于受体动物的免疫系统，系统循环可以把抗Ⅱ型胶原的“信号”通过耳蜗的螺旋轴静脉和动脉传输到内耳，从而引起内耳的免疫损伤。
本研究发现并非所有动物都有听力学变化，仅在部分动物出现了ABR各波潜伏期、Ⅰ~Ⅲ波波间期和听力阈值的改变。Ⅲ组2周处死的动物36耳中有13耳出现听力阈值升高，听损率为36.11%，改变范围在10 dB~30 dB之间，阈值提高最多的为30 dB。Ⅲ组3天处死的动物38耳中有8耳出现听力阈值升高，改变范围均在10 dB左右，但一些阈值无提高动物各波潜伏期有延长。2周较3天听力阈值有升高，且2周较3天听损率也有升高。本研究在所有免疫组动物都没发现明显的内淋巴积水（病理切片观察前庭膜无外移）。
Ⅲ组3天时没发现螺旋神经节细胞的形态和数量明显改变。Ⅲ组2周时发现3只动物有轻度的螺旋神经节细胞变性，表现为细胞核固缩，这与 Ahmed［3］的结果一致，但较Yoo等［4］的模型中病变程度轻、损伤比率也低，他用鸡Ⅱ型胶原免疫的动物中大部分都出现了螺旋神经节细胞变性，并且变性的范围较广。已有研究证明系统循环的淋巴细胞是通过中轴螺旋静脉进入内耳的［5］。本研究观察到耳蜗中轴较大的血管管壁增厚，管腔变小，血管周围局限性单核细胞渗出，有时伴随一些浆细胞，呈血管炎改变，这与Harris尸检结节性多动脉炎患者颞骨得出的结论一致［6］。一般认为血管炎（脉管炎）是自身免疫性疾病的基本特征，属早期改变,血管内皮细胞周围炎起着重要作用［7-9］。
扫描电镜在Ⅲ组3天和2周均发现第三排外毛细胞的病理性改变，而第一、二排外毛细胞无明显变化。这一发现与耳蜗毛细胞的血液供应特点有一定的联系。本研究中也观察到了耳蜗中轴血管的炎症改变；随着炎症的进展管壁增厚、管腔变窄，供血能力下降，耳蜗组织缺血，遂产生毛细胞损伤，而且远离中轴的第三排外毛细胞损伤较重。
3.2 炎症因子ICAM-1在AIED中的致病作用
本研究观察到，Ⅲ组末次抗原激发后3天ICAM-1呈强表达，主要分布在血管内皮细胞、螺旋神经节细胞、螺旋韧带、血管纹、Corti器。Ⅲ组2周时这些细胞及组织ICAM-1表达明显减弱，但免疫造成的内耳损伤继炎症因子的表达之后逐渐加重，这在扫描电镜和ABR测试结果都可得以证明。ICAM-1在炎症的早期发挥作用，诱导炎性细胞移行到组织中，继而炎症细胞又分泌各种其他炎症因子，或产生抗体继续损伤组织。一般认为内耳免疫反应的最初阶段是造成内耳组织损伤引起AIED的关键阶段。在免疫反应中，抗原的提成、循环中炎性细胞大量浸入炎症组织以及介导杀伤靶细胞等作用，需要通过免疫活性细胞表达的粘附分子使细胞间粘附聚集才能完成。
参考文献
［1］ Yoo TJ, Floyd RA, Sudo N, et al. Factors influencing collagen-induced autoimmune ear disease［J］.Am J Otolaryngol,1985,6(3):209-216.
［2］ 张学渊,袁伯庆.人Ⅱ型胶原免疫豚鼠致内耳损害的研究［J］.中华耳鼻咽喉科杂志,1992,27(1):11-13.
［3］ Ahmed M.Soliman,M D.Type Ⅱ collagen-induced inner ear disease:critical evaluation of the guinea pig model［J］.The American Journal of Otology, 1990,11(1):27-32.
［4］ Yoo TJ.Type Ⅱ collagen-induced autoimmune inner ear lesions in guinea pigs［J］.Ann Otol Rhinol Laryngol Supple,1984,113(1):3-5.
［5］ Gloddek B, Ryan AF, Harris JP. Homing of lymphocytes to the inner ear［J］.Acta Otolaryngol, 1991,111 (6):1051-1059.
［6］ Harris JP, Ryan AF.Fundamental immune mechanisms of the brain and inner ear［J］.Otolaryngol Head Neck Surg,1995,112 (6):639-653.
［7］ Veldman JE, Roord JJ, O' Connor AF, et al.Autoimmunity and inner ear disorders:An immune complex mediated sensorineural hearing loss［J］. Laryngoscope,1984,94 (4):501-507.
［8］ Terrayama Y,Sasaki Y.Studies on experimental an isoimmune labyrinthitis in guinea pigs［J］. Acta Otolaryngol,1963,58(1):49-58.
［9］ Gloddek B, Lamm K, Arnold W. Pharmacological influence on inner ear endothelial cells in relation to the pathogenesis of sensorineural hearing loss［J］. Adv Otorhinolaryngol,2002,59(1):75-83.
基金项目：河南省优秀中青年骨干教师资助课题（2001006）
（河南省郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450052）