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【摘要】 目的：观察AngⅡ对体外培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）表达粘附分子（ICAM-1和VCAM-1）及内皮NO生成的影响，讨论三者之间的关系和可能机制。 方法：采用胰蛋白酶消化法进行HUVECs的原代培养，3～5代用于实验；通过RT-PCR和Western Blot检测两种粘附分子的mRNA和蛋白表达水平；利用Griees反应原理测定上清NO释放量。结果：HUVECs未活化时不表达VCAM-1而ICAM-1呈低表达状态；AngⅡ在生理浓度时（10-9 mol/L）即可刺激HUVECs表达ICAM-1和VCAM-1 mRNA,随浓度增加表达增强；10-7 mol/L AngⅡ 在不同时间点刺激HUVECs 6 h即有ICAM-1 mRNA和VCAM-1 mRNA较高表达，但高峰有所不同，前者在10 h左右，后者为12 h。在AngⅡ刺激下两种粘附分子的蛋白表达水平和趋势与mRNA相似；并随浓度增加而明显抑制NO生成。结论：AngⅡ明显增强HUVECs表达粘附分子，并抑制其NO生成，具有显著的促炎和促动脉粥样硬化作用。
【关键词】 血管紧张素 细胞间粘附分子-1 血管细胞间粘附分子-1 一氧化氮
AngⅡStimulates Adhesion Molecules and reduces the production
of NO in HUVECs
DING Yue-xia1, LIU Qi-cai2
(1.Department of Cardiology, the Second Affiliated hospital of Guangzhou Medical College, Guangdong 510260, China)
【Abstract】 Objective：AngiotensinⅡ (AngⅡ), the effectors peptide of the renin-angiotensin system, has been implied in the pathogenesis of arteriosclerosis and hypertension on various levels. AngⅡ-induced endothelial dysfunction, endothelial cell apoptosis, and lipoprotein peroxidation. AngⅡ also induces cellular adhesion molecules and decreases NO, all of which participate in the induction of an inflammatory response in the vessel wall. In addition, while all of these effects contribute to neointima formation and development of atherosclerotic lesions, AngII may also be involved in acute complications of atherosclerosis by promoting plaque rupture and a hyperthrombotic state. Accordingly, AngⅡ appears to have a central role in the pathophysiology of arteriosclerosis. Methods:Human umbilical vein was isolated and culcured.Passage 3-5 of cultured HUVECs were incubated for 2、6、9、12、24 h with 10-7 M AngII or 10-9-10-6M for 12 h.Results: Total RNA was extracted, and the expression of mRNA and protein of ICAM-1 and VCAM-1 was assessed by RT-PCR and Western Blot; While measured NO production via Griess (nitrate reductase method ).Conclusions: AngⅡ could stimulate the expressions of ICAM-1 and VCAM-1 on dose or time dependant both RNA and protein. Another, AngⅡ could decrease NO production on dose.
【Key words】AngiotensinⅡ；Intercellular adhesion molecule-1；Vascular cell adhesion molecule-1；Nitric Oxide
在动脉粥样硬化(AS)的形成过程中,血管内皮结构及功能的改变及局部炎症反应起重要作用。其中内皮细胞(EC)通过产生血管活性物质如NO、AngⅡ等调节着血管的张力及结构［1］。AngⅡ处于肾素血管紧张素醛固酮系统的核心地位。循环及局部的AngⅡ作为血管活性肽，在AS和高血压的发病中发挥主要作用。它介导EC损伤、诱导EC凋亡、加速脂质过氧化、促进血管平滑肌细胞迁移增殖、诱导细胞因子及致炎物质的分泌如白介素-1(IL-1)、血管细胞间粘附分子（VCAM-1）、细胞间粘附分子（ICAM-1）及P、E-选择素等，这些活性物质又作用于EC促使更多的致炎物质分泌，进一步加重内皮功能紊乱、加速AS和高血压的进展［2-4］；NO与AngⅡ有着相反的作用，NO是体内做为重要的心血管保护因子，是强有力的内皮源性血管舒张因子,对维持血管内皮结构和功能具有积极的作用。研究表明AngⅡ激活核转录因子kappaB(NFκB)，从而诱导其下游靶基因的表达如ICAM-1和VCAM-1，而EC粘附分子表达增多是AS发病的始动环节，但AngⅡ与EC表达ICAM-1、VCAM-1和NO之间的关系和相互作用机制并不明了。本研究利用体外培养的HUVECs观察AngⅡ对EC表达ICAM-1和VCAM-1及内皮NO生成的影响。
1 材料和方法
1.1 材料 健康产妇正常分娩新生儿脐带,标本取自广州医学院附属医院妇产科。RPMI1640培养基、胰蛋白酶、内皮细胞生长因子、AngⅡ购自Sigma公司;特级胎牛血清为Hyclon公司产品； Trizol试剂、RT-PCR试剂盒购RT-PCR两步法试剂盒（Invitrogen公司）；抗ICAM-1及VCAM-1一抗、二抗购自R&D公司；DAB试剂盒（博士德公司产）；NO生成试剂盒（南京建成生物公司产）。
1.2 方法
1.2.1 原代人脐静脉内皮细胞培养、传代、鉴定及分组 无菌条件下取正常分娩4 h内的脐带20~25 cm,用灭菌PBS(pH 7.2)冲洗干净脐静脉后注入0.25％胰蛋白酶,置37 ℃水浴消化8~12 min。收集消化液,再用20%FBS的RPMI1640灌洗、离心（1 000转/min,5 min）收集细胞,制成细胞悬液按(1~1.5)×106个/mL接种于50 mL培养瓶中,在37 ℃、5%CO2条件下培养。达90％以上单层融合状态时用0.25％胰蛋白酶和0.01%EDTA（1：1）消化、传代培养，经Ⅷ因子抗体免疫组化鉴定为血管内皮细胞后3～5代用于以下实验。细胞分①无刺激组，除培养液（含10％FBS）外不加任何处理；② AngⅡ处理组：分别用10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L AngⅡ刺激HUVECs 12 h和10-7 mol/L AngⅡ刺激HUVECs 2、 6、9、12、24 h后测定ICAM-1和VCAM-1 mRNA；测定其浓度组（0、10-8、10-7、10-6 mol/L）蛋白表达以及上清液的NO浓度。
1.2.2 半定量RT-PCR 各组细胞以(2~3)×105个/mL接种至6孔板，每组至少为6个孔，待细胞长至90％以上的融合状态时弃旧培养液，换为含10％FBS和0.1 ml/mg内皮细胞生长因子的RPMI1640(2 ml/孔)，次日按上述分别处理细胞，到时间后收集并提取总RNA：采用Trizol试剂一步法抽提。RT-PCR为两步法，按照试剂盒说明书进行。RT过程简言之：各组RNA定量2 μg、Oligo(dT18)1μL 、10 mM dNTP混合物2μL加DEPC处理水至总体积为12 μL,65 ℃温育5 min后置于冰上，加入8 μL下列反应体系：5хcDNA合成缓冲液4 μL、0.1MM DTT 1 μL、RNaseOUTTM 1 μL 、DEPC处理水1 μL、ThermoScriptTMRT 1 μL ,放在热启动PCR仪中设置程序55 ℃ 50 min逆转录反应；85 ℃、5 min灭活ThermoScriptTMRT。PCR反应体系如下：10хPCR缓冲液2.5 μL、50mM MgCl2 0.75 μL、10 mM dNTP混合物0.5 μL、5 μM上下游引物混合液3 μL、Taq酶0.25 μL补DEPC水至总体积为25 μL 。PCR反应条件为：预变性94 ℃ 3 min,变性94 ℃ 40 s、退火53 ℃ 60 s、延伸72 ℃ 60 s、循环32轮，后72 ℃延伸5 min。ICAM-1引物序列正义：5′-CTTCCTGACGGATGCCAGCT-3′反义：5′-GGGAGTCCTCCAATACCTTGG -3′，cDNA的长度689bp；VCAM-1引物序列正义5′-AGTGGTGGCCTCGTGAATGG-3′：反义：5′-VTGTGTCTCCTGTCTCCGCT -3′，cDNA的长度700bp；GADPH引物序列正义：5′- CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′反义: 5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′，cDNA的长度300 bp。PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳(100 V、65 mA、20 min),DNA Marker购自TaKaLa公司，紫外灯下照相。
1.2.3 Western Blot 按照《分子克隆指南》，简述之：每组细胞以(2~3)×106个/mL接种至25 cm2的一次性塑料培养瓶中，长至90％的融合状态时给予上述处理，按分组提取20 μg的细胞蛋白抽提液,以体积分数为10%的SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。待电泳完毕后用BioRad公司的半干电转移槽转移至硝酸纤维素膜上,在室温下用封闭缓冲液(10 g/L脱脂奶粉,0.3％TWEEN20,PBS)封闭3 h。分别再依次与ICAM-1和VCAM-1的一抗,二抗(酶标HRP抗体)反应后,增强化学发光法显色,X线底片曝光显影。
1.2.4 NO测定 严格按照试剂盒说明书进行操作，简述如下：将3~5代的HUVECs以2×105个/ml的密度接种在6孔板中，测定前24 h换为无血清培养，之后按组收集细胞培养液，每组至少6个复孔，每次实验独立操作至少3次。每组取样500 μL（空白管取等量的去离子水；标准管取等量的20 μmol/L的亚硝酸钠），分别加入Griess试剂（1号和2号试剂混合物）1.2ml,涡旋振荡混均匀后静置10 min,4 000转/min离心10 min，取澄清的上清液0.8 ml，加入提前配置好的显色剂0.4 ml，混匀放置15 min，用721型可见光分光光度仪测定550 nm的OD值。根据所得的OD值，计算NO的浓度：（测定管OD值－空白管OD值）÷（标准管OD值－空白管OD值）×标准管浓度（20 μmol/L）×样品测试前的稀释倍数（1.0），得出的数据均以均数±标准差表示，并绘制标准曲线。
1.2.5 统计学处理 结果均以均数±标准差表示，采用SPSS1.0统计软件，单因素方差分析，P<0.05统计学上有显著性差异。
2 结果
2.1 AngⅡ上调HUVEC表达ICAM-1和VCAM-1mRNA 如图1所示HUVECs未活化时ICAM-1表达很低而无VCAM-1表达, 10-9 M AngⅡ就明显上调ICAM-1（1.0倍）和VCAM-1mRNA（A值0.95），随浓度增大表达增强,分别是对照组的2.2、2.5和3倍；VCAM-1的A值较10-9M组有明显升高，分别是该组的1.2、1.3、1.4倍。10-7 M AngⅡ刺激HUVECs 2 h即可上调这二种粘附分子mRNA的表达，P<0.001，12 h更明显，24 h达高峰。与2 h组对比，各时间组分别增加1.08、1.17、1.18、1.21倍和1.07、1.12、1.15、1.17倍。图1 AngⅡ诱导HUVECs ICAM-1 mRNA 表达的量-时效应
上图为ICAM-1的RT-PCR电泳图。M:marker;a图中1:无刺激组；2~5分别为10-9-10-6 M的AngⅡ组；b图中1-6分别为10-7M AngⅡ刺激HUVECs 0、2、6、9、12、24小时。下图为各组ICAM-1/GADPH的光密度比值均数图。
图2 AngⅡ诱导HUVECs VCAM-1 mRNA 表达的量-时效应
上图为VCAM-1的RT-PCR电泳图。M:marker;a图中1:无刺激组；2-5分别为10-9-10-6 M的AngⅡ组；b图中1-6分别为10-7M AngⅡ刺激HUVECs 0、2、6、9、12、24小时。下图为各组VCAM-1/GADPH的光密度比值均数图。
2.2 AngⅡ诱导HUVEC表达ICAM-1和VCAM-1 HUVECs未活化时ICAM-1表达很低而无VCAM-1表达，随着AngII浓度（10-8、10-7、10-6M）增大HUVECs表达ICAM-1和VCAM－1明显增强，与无刺激组相比较，其灰度值分别是1.19±0.13,P<0.01；1.75±0.02、2.01±0.10,P<0.001和1.24±0.17、1.76±0.10、1.97±0.21,P<0.001。ICAM-1上调1.19、1.75、2.01倍；VCAM-1上调1.24、1.76、1.97倍，呈明显的浓度趋势（图3）。图3 AngⅡ诱导HUVECs VCAM-1 mRNA表达的量-时性
上图a和b分别代表VCAM-和ICAM-1蛋白电泳图。M：marker; 1:无刺激组：2-4分别为10-8-10-6M的AngⅡ组。右侧图为各组VCAM-1和ICAM-1电泳灰度扫描比值。以10-8M AngⅡ组灰度值设为1，各组与之相比，因为无刺激。
2.3 AngⅡ减少HUVECs的NO生成 实验分无刺激组和AngⅡ3个剂量组(10-8、10-7、10-6 mol/ L)。在无血清培养24 h，按终浓度分别加入AngⅡ培养12 h后测定每瓶上清液的NO浓度。如表1所示，对照组NO浓度为(50.21±4.39)μM(n= 6 ,n为细胞瓶数，以下与此相同)；AngⅡ3个剂量组NO浓度分别为（30.01±4.10） μM、（21.33±4.81）μM、（16.35±2.56）μM。与无刺激组相比，NO明显减少，呈剂量依赖性(图4和表1)，分别减少40、58、68（％）,P<0.01、0.001。
3 讨论
在AS和高血压的发生和发展中都存在内皮功能障碍及局部炎症反应，而高血压又是AS发生的独立高危因素，但它们之间的关系和机制尚未完全明了［3，5］。体内AngⅡ和NO是一对彼此对立而又互相影响的血管活性物质。生理条件下NO主要来源于心血管EC，由依赖Ca2+ 的内皮源性一氧化氮合酶（eNOS）催化L-精氨酸合成，发挥积极的心血管保护作用；在炎症反应及细胞因子、AngⅡ等诱导血管壁细胞（如平滑肌细胞、EC）和单核巨噬细胞、中性粒细胞等炎细胞表达诱导型一氧化氮合酶（iNOS）生成过量NO（iNO）,后者很快与过氧化亚硝酸盐阴离子结合生成活性氧，进一步加重血管壁结构和功能的损伤。对AngⅡ诱导血管EC表达eNOS和iNOS及对其NO生成的影响尚有异议。短时间（一般在几分钟内，小于30 min）作用于血管内皮细胞可明显上调eNOS，并增加NO的释放量，而对iNOS无影响；但是长时间的与EC孵育，对两者的影响报道不一；多数学者认为AngⅡ长时间刺激EC可以明显抑制NO的释放。在我们的实验条件下，AngⅡ呈浓度效应抑制HUVECs的NO生成。同样，与其他人的研究结果一致，在AS和高血压早期，中性粒细胞的渗出、单核巨噬细胞内皮下募集，活化内皮是发病的始动环节之一。在此血管内皮细胞分泌和表达ICAM-1及VCAM-1增高起着至关重要的作用。大量实验证明AngⅡ可诱导EC、血管平滑肌细胞表达粘附分子［2］。我们的研究结果表明：AngⅡ通过抑制HUVECs释放NO，诱导其表达ICAM-1和VCAM-1上调而发挥促炎和促AS作用，其机制可能是通过AT1介导，增强NFκB的表达，从而上调下游靶基因的转录如VCAM-1和ICAM-1、iNOS［5-7］，刺激活性氧的生成，参与体内的氧化应激，其具体机制和信号通路有待于我们进一步的研究。
【参考文献】
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作者单位：广州医学院附属第二医院心内科，广东 广州 510260