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【摘要】 目的：研究过氧化质体增殖物激活受体（Peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR）γ2基因Pro12Ala多态性是否与Ⅱ型糖尿病（IDDM）的易感性相关。方法：通过PCR-RFLP方法,对275例糖尿病患者和286例正常人进行了PPAR基因Pro12Ala多态性分析，比较各组间等位基因型及等位基因频率的分布。结果：研究对象中共见有2种基因型, Pro/Ala杂合子等位基因型, Pro/Pro纯合子等位基因型。IDDM患者基因型Pro/Ala、Pro/Pro频率分别为10%、90%，x2=3.39, P>0 05，而对照组Pro/Ala、Pro/Pro频率分别为5%、95%；IDDM患者等位基因Pro和Ala频率分别为95%、5%，x2=3.27,P>0 05，而对照组Pro和Ala频率分别为98%、2%。结论：糖尿病患者与对照组之间Pro12Ala多态性频率存在差异，但不显著。PPARγ2基因Pro12Ala多态性与Ⅱ型糖尿病的易感性可能无关。
【关键词】 糖尿病；Ⅰ型糖尿病；Ⅱ型糖尿病；过氧化质体增殖物激活的受体；限制性片段长度多态性
Relationship between Peroxisome proliferator-activated receptor gamma2 Pro12Ala Gene Polymorphism and Diabetes Mellitus Patient
ZHOU Jian
(The Centre Hospital of Jiang Han Oilfield, Hubei 433124, China)
【Abstract】 Objective：To investigate whether Peroxisome proliferator-activated receptor（PPAR）γ2 gene Pro12Ala polymorphism is associated with the susceptibility to diabetes mellitus（DM）. Methods:In this experiment, we analyze the PPARγ2 gene Pro12Ala polymorphism in 561 Chinese subjects including 275 patients with IDDM and 286 control subjects by the PCR－PFLP method. The genotype frequencies for Pro/Ala，Pro/Pro were 10% and 90%, respectively, in the DM group ，and 5%,95% in the control subjects.Results: The Pro/Ala frequency is not significantly higher in the patients than in the control group (P>0.05), and so is the Ala allele, suggesting that the Pro/Ala genotype maybe not associated with the susceptibility to IDDM in our study group.Conclusions: There maybe no correlation between PPARγ2 gene Pro12Ala polymorphism and susceptibility to IDDM．
【Key words】Diabetes mellitus；TypeⅠDiabetes mellitus；TypeⅡDiabetes mellitus；Peroxisome proliferator-activated receptorγ2Gene polymorphism
过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)是一类由配体激活的核转录因子超家族成员。PPARγ是其3种亚型之一，在脂肪细胞分化和糖、脂代谢中发挥着重要作用。在体外培养的脂肪细胞中，用胰岛素可诱导其表达，与降糖药噻唑烷二酮结合还可以增加胰岛素的敏感性，因而被认为是糖尿病的易感基因之一［1］。PPARγ基因外显子2的第12位密码子CCA→GCA突变，造成脯氨酸转变为丙氨酸，即Pro12Ala多态性。PPARγ2的氨基端含有一个不依赖于配体而依赖于胰岛素的活化区域，Pro12Ala即位于该区域内［2］。国外有研究显示Pro12Ala多态性与胰岛素敏感性相关［3，4］。糖尿病主要分为Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病。Ⅰ型主要是因自身免疫，胰岛B细胞受损造成胰岛素分泌绝对不足；Ⅱ型糖尿病以胰岛素抵抗为主伴胰岛素分泌相对不足。近年来，糖尿病（diabetes mellitus DM）患者人数不断攀升，已成为继肿瘤、心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病［5］。而Ⅱ型糖尿病占糖尿病总人数的80%以上，研究Ⅱ型糖尿病胰岛素抵抗的机理以及与遗传基因的关系对于该多发病的胰岛素抵抗机理尤其是指导治疗意义重大。本文就PPARγ2基因Pro12Ala多态性与Ⅱ型糖尿病关系作一研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 血样
275例按照1999年ＷＨＯ诊断标准确诊的Ⅱ型糖尿病患者,彼此间无血缘关系，分别来自江汉油田中心医院和武汉市；286例正常对照组为湖北地区无血缘关系的个体，无内分泌疾病，肝肾功能正常，采血在空腹时进行，具体见表1：表1 糖尿病和对照组基本情况表（略）
1.1.2 酶和试剂
Taq酶、dNTP购自杰辉生物制品公司；引物由上海博亚生物技术公司合成，Marker为PGEM 7ｚｆ(+)HaeⅢ，其它常规试剂采用进口分装或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取
取EDTA抗凝的外周静脉血0.2 ml NaI裂解,氯仿/异戊醇、异丙醇沉淀法提取基因组DNA,溶于TE后4 ℃保存。
1.2.2 引物设计
参照文献［6］，由上海博亚生物技术有限公司合成。
上游引物序列为： 5'-GCCAATTCAAGCCCAGTC-3'
下游引物序列为:：5'- GATATGTTTGCAGACAGTGTATCAGTGAAGGAATCGCTTTCCG -3'
1.2.3 PCR扩增
条件:反应总体积为20 μＬ,含DNA样品约200 ng,10×buffer 2 μＬ, Ｍg2+ 1.5 μＬ, 10 mmol/Ｌ dNTP 1 μL,引物各20 pmol,Taq DNA聚合酶1.5 Ｕ，95 ℃预变性5 min,继之30个循环,循环条件为95 ℃ 40 s, 60 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min;最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经1 % 琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭显色,紫外灯下观察扩增结果。
1.2.4 BstU I酶切及聚丙烯酰胺凝胶电泳分型
取PCR产物7 μＬ，10×buffer 2 μＬ，BstU I 限制性内切酶1.5 U，补充蒸馏水至20 μＬ，37 ℃水解过夜，用8 %非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分型,银染检测。
1.2.5 统计学分析
运用Hardy-Weinberg平衡检验确认样本的群体代表性，变量用平均值±标准差表示，分别计数各组PPARγ2基因Pro12Ala基因频率和等位基因频率，各组间频率比较用x2检验，P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 PPAR基因多态性
PPAR基因经PCR扩增后应该有3种基因型:Pro/Pro纯合子为270 bp 1条带；Pro/Ala杂合子为270 bp、227 bp、43 bp 3条带。由于43 bp条带为引物所遮盖，不能显示，故Pro/Ala杂合子只显示2条带：270 bp和227 bp。
2.2 糖尿病患者和对照组PPARγ2 Pro12Ala基因多态性比较
从表2中可以看出， Ⅱ型糖尿病Pro/Ala基因型频率为10%，高于对照组的5%；Ⅱ型糖尿病中Ala等位基因频率为5%，略高于对照组的2%。表2 糖尿病和对照组PPARγ2 Pro12Ala基因多态性频率比较（略）
2.3 统计学分析
各基因频率分布符合Hard-Weinburg遗传平衡，具群体代表性。Ⅱ型糖尿病等位基因频率x2=3.27,P>0.05;基因型频率x2=3.39, P>0.05。
2.4 中国人与其他种族人群PPARγ2基因Pro12Ala多态性基因型频率比较
关于PPARγ2基因Pro12Ala多态性是否与DM易感性相关，不同国家的文献报道并不一致。日本、巴西等国的一些学者认为两者有相关性［9，10］，而以高加索人群为研究对象的学者认为并无相关性。研究结果存在差异可能与不同的人种相关［12］。表3 不同种族PPARγ2基因Pro12Ala多态性分布的比较（略）
本研究人群PPARγ2基因Ala/Ala和Pro/Ala基因型的频率为7.5％,较日本人［9］的5.9％略高，与南亚人相同；但比起印度人的15.4％、巴西人的17.1％、瑞典人的30.6％、德国人的19.6％又明显偏低，由此可见，PPARγ2基因Ala/Ala和Pro/Ala基因型的频率存在明显的种族差异。
3 讨论
人PPARγ基因定位于3p25，有9个外显子，全长均大于100 kb。由于5’端剪切方式不同产生3种亚型：γ1、γ2、γ3。人PPARγ2 由8个外显子编码，其含量占总的PPARγmRNA的20％，仅在脂肪组织中可测得出其表达［7］。近来研究发现白色脂肪组织不仅是能量代谢的场所,也是分泌多种激素、细胞因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)及瘦素(leptin)等的内分泌器官,而TNF-α及leptin均能产生或加重胰岛素抵抗,减弱胰岛素信号转导。活化的PPARγ不但能抑制脂肪细胞表达ＴＮＦ α,减轻ＴＮＦ α诱发的胰岛素抵抗,且能增强胰岛素的信号转导［8］。至于PPARγ2 Pro12Ala多态性是否与糖尿病相关，国内外众说纷纭。有部分学者认为Ala基因可能与增加胰岛素敏感性、减少糖尿病的发生有关［9，10］。本研究得出不同结论，实验显示糖尿病组中的Ala等位基因频率略高于对照组，虽然这种差异并无统计学意义。这与以高加索人群为研究对象的国外PPARγ2 Pro12Ala多态性研究［11］得出结论类似。目前关于这方面的研究仍缺乏强有力的证据，需要进一步研究。
【参考文献】
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作者单位：江汉油田中心医院，湖北 潜江 433124