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【摘要】 目的 研究大鼠脓毒血症时肠道组织匀浆TNF-α、MCP-1的含量与肠道组织细胞中NF-κB活性的相关性，并且利用中药川芎嗪治疗脓毒血症，找到抑制NF-κB的药物和方法。方法 采用盲肠结扎穿孔术做大鼠的脓毒血症模型。分别在术后1、3、6、12、24、48h活杀大鼠，取大鼠肠粘膜组织，用酶联免疫法测TNF-α、MCP-1的含量，用凝胶电泳迁移法测NF-κB的活性。同时有同时间对照组检测;然后在脓毒血症模型基础上，利用川芎嗪和生理盐水治疗，分别在治疗后12、24、48、72h活杀大鼠，用同样的方法检测TNF-α、MCP-1的含量以及NF-κB的活性。结果 治疗前，NF-κB的活性、TNF-α、MCP-1的含量在大鼠脓毒血症时明显升高，与对照组对比差异有显著性（P<0.01）;治疗后，NF-κB的活性、TNF-α、MCP-1的含量与对照组相比差异有显著性（P<0.05）。结论 TNF-α、MCP-1是脓毒血症早期激活的细胞因子，它们的释放与NF-κB的活性密切相关;川芎嗪可以抑制NF-κB的活性，并因此使炎症细胞因子的释放减少，从而达到抑制炎症反应的作用，为临床上治疗危重病提供了新的方法和途径。
关键词 真核转录因子-κB 脓毒血症 川芎嗪
Inhibited effect of tetramethylpyrazine to nuclear factor-kappaB activation by sepsis in rats Jiang Li The First Hospital Affiliated to Dalian Medical University，Dalian116011. 【Abstract】 Objective Nuclear factor-kappaB is the central role of sepsis.To investigate activation of nucleˉar factor-kappaB，and effect of tetramethylpyrazine in intestines tissues in rat.Methods Sepsis was produced in rats by cecal ligation and puncture.Changes in NF-κB actitivty、TNF-αlevels in intestinestissues were determined by electrophoretic mobility gel-shift assay and enzyme-linked immunosorbent assay，respectively.Results NF-κB activity、TNF-αlevels in intestines tissues were significantly increase in rats with sepsis;After tetramethylpyrazine treatment，those index were restrained obviously，and there was asignificant difference between the treatment group and control group（P<0.05）.Conclusion Tetramethylpyrazine can restrain nuclear factor-kappaB activation，and reˉstrain development of sepsis. Key words nuclear factor-kappaB sepsis tetramethylpyrazine 脓毒血症是感染因素所导致的系统性炎症反应（SIRS），感染来源于细菌、原虫或病毒。严重的脓毒血症伴随单一或多器官的功能失常。细胞因子被认为是对人体防御功能起重要作用的大量细胞所产生的一组小信号蛋白。虽然细胞因子对自身防御功能很重要，但是过度的产生和释放会造成广泛的组织损伤而导致多器官功能障碍综合征（MODS） ［1］ 。脓毒血症正是由于细胞因子过度释放入血而产生系统过强的炎症反应所致。真核细胞转录因子-κB（NF-κB）是一组近年来发现的核转录调节因子;NF-κB在调节重症疾病的免疫调节基因方面有特殊的作用，尤其在调节ARDS或MODS等疾病的细胞转录因子、粘附分子等方面起到核心作用。广泛的细胞外刺激（包括细菌、病毒等的产物）可以刺激激活NF-κB的活性。NF-κB活化而发生核易位，其目的靶基因的启动因子或增强子上特定的κB系列特异结合，启动和调控一系列参与炎症反应的炎症因子表达而介导SIRS甚至MODS的产生。TNF-α是引起多种促炎细胞因子和炎症介质失控性释放，导致SIRS或MODS的关键细胞因子。TNF已经被认为是机体在慢性局限性或系统炎症的发病机制中的潜在的前炎症分子 ［2］ 。最近研究表明，在脓毒血症患者肠道的完整性对临床痊愈起重要的决定性作用。在正常生理状态下，肠道提供了抵御有毒的肠内容物包括细菌和内毒素的关键屏障作用 ［3］ 。脓毒血症引起的MODS一个可能的机制是无法控制的系统性炎症反应（SIRS），而SIRS是宿主的免疫系统不适当的激活从而导致一系列的器官损伤和功能不全 ［4］ 。而这种损害会造成免疫介导的细胞坏死或激活细胞凋亡的通道 ［5，6］ 。本实验研究大鼠的脓毒血症时肠道组织匀浆TNF-α的含量与肠道组织细胞中NF-κB的活性的相关性，找出其间的联系。并且利用中药川芎嗪治疗脓毒血症，找到抑制NF-κB的药物和方法。 1 材料与方法 1.1 实验动物和主要试剂 健康雄性SD大鼠，体重180～230g（由大连医科大学动物中心提供）;二硫苏糖醇（DTT）、NP-40、苯甲基磺酰氟（PSMF）、考马斯亮蓝（CBBG-250）、POLY（di-dc）HEPES、Leupeptin、胶原酶、Aprotinin、Pepstatin、α- 32 PdATP、兔抗人P 50 单克隆抗体（以上试剂均来自USA）、氯胺酮、双链寡核苷酸探针:5′-AGC TTC AGA GCG GGG GAC TTTCCG AGA GG-3′;3′-AGTCTC CCC TGA AAG GCT CTC CAG CT-5′（大连宝生物细胞研究所提供）、TNF-α酶联免疫吸附（ELISA）测定试剂;流式细胞仪、低温离心机、分光仪、垂直电泳槽、电泳仪、凝胶干燥仪等。 1.2 实验步骤 （1）大鼠分组SD大鼠48只，分成12组，每组4只，其中6组为致伤组，分别在伤后1、3、6、12、24、48h活杀;另外6组为对照组，同样时间活杀。（2）两组大鼠均采用腹腔麻醉，12h前禁食水。致伤组采用盲肠结扎穿孔术后编号（使用两种染料，一种个位，一种十位），置入笼内自由活动，不限饮食，每隔3～4h观察1次;对照组，同样开腹，但是不结扎、不穿孔，同样时间活杀，编号。（3）组织匀浆液的提取:依照Tulzo ［7］ 的方法，收集匀浆上清-20℃保存，取匀浆上清测定TNF-α含量，ELISA法测定按照试剂盒说明进行。（4）组织核蛋白提取和κB序列双链寡核苷酸探针的标记依据Deryckere ［8］ 的方法，组织收集上清，用Bradford法测定其浓度，核蛋白-70℃保存备用。（5）含κB序列的双链寡核苷酸探针T4多核苷酸激酶催化下，用αˉ 32 PdATP标记探针5′端，纯化后测定探针的比放射性。（6）胃肠组织核蛋白提取物中NF-κB活性及特异性的检测:参照Shenkar ［9］ 的方法，用凝胶电泳迁移率改变法（EMSA）检测，进行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳毕将凝胶置干燥仪中烘烤，室温下放射自显影24～48h。（7）大鼠分组:SD大鼠8只，分2组，每组4只。均用盲肠穿孔法（CLP）致伤，然后分川芎嗪组、温生理盐水对照组二组，均治疗后观察12、24、48、72h相应点活杀大鼠采取同样步骤测定上述几项指标。药物治疗:川芎嗪与生理盐水（60mg/kg）均为腹腔内注射，每次10ml，每3h1次，共3次。 1.3 统计学方法 实验数据以（ˉx±s）表示，SPSS软件分析。数据分析使用t检验和方差分析。 作者：
蒋丽 2005-9-21