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【摘要】 目的 观察补肾活血冲剂对再生障碍性贫血（AA）小鼠骨髓造血微环境及骨髓细胞黏附分子表达的影响。 方法 给小鼠按15mg/kg体重剂量腹腔注射马利兰，每周1次，连续5周，诱发骨髓损伤、造血功能障碍后，予补肾活血冲剂灌胃3个月进行干预，观察其骨髓结构变化、体外成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）、骨髓单个核细胞CD49d、CD49c的表达水平、骨髓基质细胞VCAM-1的表达。 结果 马利兰诱发的小鼠骨髓损伤符合AA的病理变化。补肾活血冲剂能促进骨髓造血微环境结构恢复，提高造血组织容量百分率及骨髓单个核细胞CD49d、CD49c及骨髓基质细胞VCAM-1的表达水平。 结论 补肾活血冲剂能改善骨髓造血微环境及提高骨髓基质细胞黏附分子的表达水平。
关键词 补肾活血冲剂 马利兰 小鼠 骨髓微环境 细胞黏附 再生障碍性贫血
造血诱导微环境（HIF）的重要组成成分是骨髓基质细胞。基质细胞通过与造血细胞密切接触，分泌细胞外基质（ECM）和多种细胞因子调节造血，其结构和功能的完整性对于保持机体在生理状态下尤其是应激状态时造血的稳定性具有十分重要的作用 ［1］ 。越来越多的事实表明，某些生物、化学或物理等因素均可通过损伤造血微环境而影响其造血功能 ［2］ ，甚至导致造血功能障碍。造血微环境损伤的病理基础是肾虚血瘀，为此我们运用烷化剂马利兰诱发小鼠骨髓结构损伤、造血功能障碍，试用补肾活血冲剂改善再生障碍性贫血（AA）小鼠造血微环境，以促进骨髓造血功能的恢复，现总结如下。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 （1）马利兰，上海华联制药公司生产，沪卫药准字（1995）第0122号-012。（2）再障生血片，吉林省辽源市中药厂生产，吉卫药准字（84）730017。（3）补肾活血冲剂，黑龙江中医药大学附属医院制剂室生产，每袋9g。
1.2 动物造模与分组 昆明种小鼠140只，随机分成正常组20只，马利兰处理组120只。正常组不予任何处理，马利兰处理组小鼠每只按15mg/kg体重剂量腹腔注射马利兰，每周1次，连续5周，查外周血象后，取80只随机分成模型组、治疗组、对照组、病理对照组，每组20只。治疗组小鼠以补肾活血冲剂，对照组小鼠以再障生血片，病理对照组小鼠以蒸馏水灌胃，每天每只2.4ml，每日3次，连续12周。
1.3 观察指标
1.3.1 外周血象检查 实验小鼠分别于造模前、造模5周后及治疗结束时查外周血象。
1.3.2 骨髓有核细胞（BMNC）计数 实验小鼠分别在用马利兰5周后及治疗结束时，断颈处死，取股骨用PBS冲出骨髓细胞，制成单核细胞悬液 ［3］ 。
1.3.3 骨髓组织学检查 取小鼠尺骨，经固定、包埋、切片、染色，高倍镜下观察微血管数、脂肪细胞、骨髓造血细胞容量百分率 ［4］ 。
1.3.4 骨髓单个核细胞（MNC）黏附分子CD49d（VLA4）、CD49c（VLA5）表达水平 调节骨髓MNC浓度为1×10 7 /ml，用流式细胞仪检测CD49d、CD49c表达水平。
1.3.5 骨髓基质细胞VCAM-1表达水平的测定 ［5］ 制备骨髓基质细胞培养体系，通过免疫组化方法（SABC法）来判定阳性细胞百分率。
1.3.6 成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）的变化 将骨髓有核细胞悬液继续培养，用倒置显微镜观察计数，来判断CFU-F的变化。
1.4 统计学方法 实验结果均用（ˉx±s）表示，采用t检验。
2 结果
在实验过程中有小鼠出现死亡，未计入结果。
2.1 小鼠的一般状态 正常组小鼠在实验过程中皮毛有 光泽，活泼，眼睛明亮，鼻唇洁净、潮湿呈淡红色，体温适中。而经腹腔注射马利兰的小鼠逐渐出现精神萎靡、行动迟缓、蜷缩懒动，皮毛欠光泽，耳鼻四肢色白欠温。经用补肾活血中药治疗后则精神状态逐渐好转，周身皮肤色泽及温度均有所改善。
2.2 外周血象变化 测定结果见表1。
表1 外周血象测定结果比较 （略）
注:分别与模型组、病理对照组比较， ▲ P<0.01;与模型组比较， ▲▲ P>0.05;与正常组比较， * P>0.05， ** P<0.01;与对照组比较， # P<0.01
2.3 骨髓组织结构变化 正常组小鼠骨髓增生活跃，造血细胞及造血微环境结构完整，造血细胞与非造血细胞以不同比例共存并均匀分布，模型组及病理对照组小鼠骨髓增生低下、造血组织容量及微血管数量显著减少，微血管极度扩张、瘀血，甚至断裂，基质疏松，以脂肪细胞为主。骨髓基质细胞VCAM-1表达水平下降（见表2），成纤维细胞集落形成单位形态及数量均有变化，数量减少，结构异常，零散分布，与正常组比较差异有非常显著性。治疗组及对照组小鼠骨髓形态结构破坏减轻，相对完整，骨髓基质细胞VCAM-1表达水平较模型组明显回升;成纤维细胞集落形成单位形态结构基本接近正常，排列较密集，成纤维细胞呈梭形，多有明显的伪足。造血组织容量及微血管数量无明显减少，微血管扩张、瘀血减轻，无微血管断裂，基质解聚不明显，以造血细胞为主。
2.4 骨髓MNC上CD49d、CD49c表达水平 结果见表2。
表2 治疗前后小鼠骨髓组织结构变化结果 （略）
注:分别与模型组、病理对照组比较， ▲ P<0.01;与模型组比较， ▲▲ P>0.05;与正常组比较， * P>0.05， ** P<0.01
3 讨论
马利兰属甲烷磺酸酯类烷化剂，以往的实验过程中发现，较低剂量时主要影响粒细胞的生成，随着剂量的递增，可依次影响血小板和红细胞造成骨髓增生低下，造血功能障碍。马利兰诱导小鼠再障这一结果已被公认，其发病与造血干细胞的直接损伤关系密切，而骨髓微环境的变化及基质细胞的作用亦不能忽视，为此我们做了这方面的实验观察，结果发现马利兰诱导再障小鼠的骨髓造血微环境严重受损，基质疏散解聚，微血管数量减少，微血管极度扩张，瘀血甚至断裂，以脂肪细胞为主。骨髓基质细胞VCAM-1表达水平下降，CFU-F结构异常、数量减少、零散分布，结果表明马利兰损伤小鼠骨髓造血微环境与小鼠骨髓造血功能障碍的发生密切相关。
造血诱导微环境损伤是再障发病的重要环节。再障属虚劳之范畴，常见的证型为肾虚血瘀。中医认为，慢性再障的中医发病基础是致病因素作用于机体后造成的肾虚，肾精不足，髓海空虚，精不化血而致血虚;肾虚日久不愈，久病入络，血行不畅致脉络瘀阻，而表现有不同程度的血瘀，是一种本虚标实、虚实夹杂疾患。治疗上当以攻补兼施，采用补肾活血为大法。由于肾藏元阴元阳，依据阴阳互根，“孤阴不生，独阳不长”的理论，故在补肾方中既运用助肾阳之药，又使用滋肾阴之品，使阴阳互用、阴平阳秘方可化生阴血。补肾活血冲剂具有滋阴助阳、养血活血之功效，方中熟地、山萸肉补肾填精、滋阴养血;鹿角胶、龟版胶补肾助阳、益髓养血;红参、黄芪补气健脾养血;当归、川芎、鸡血藤活血化瘀、祛瘀生新。现代药理学研究表明当归、丹参、鸡血藤、白芍、川芎等具有改善造血微环境的作用。补肾活血冲剂通过改善再障小鼠骨髓造血、诱导微环境及提高骨髓基质细胞黏附分子的表达水平来促进骨髓造血功能的恢复，实为攻补兼施、标本兼治之大法的具体应用，同时为进一步明确中医药治疗再障的疗效提供了实验依据。
参考文献
1 Kim CH，Broxmeyer HE.In vitro behavior of hematopoietic progenitor cells under the influence of chemoattractants:stromal cell-derived fac-tor-1.steel factor and the bone marrow environment.Blood，1998，91（1）:100.
2 Greenberger JS.Toxic effects on the hematopoietic microenvironment.Exp Hematol，1991，19:1101.
3 唐佩弦，杨天楹.造血细胞培养技术.西安:陕西科学技术出版社，1985，147-160.
4 浦权，李世俊，杨梅如.骨髓活检病理学.哈尔滨:黑龙江科学技术出版社，1993，59-62.
5 孙汉英，舒砚君，刘文励，等.川芎嗪改善免疫诱导再生障碍性贫血小鼠骨髓微环境作用的研究.中华血液学杂志，1998，19:178-180.
（编辑商志伟）
作者单位:100078北京中医药大学东方医院血液免疫科