马鞭草C部位对人绒毛膜癌JAR细胞体外抑制作用的研究

    【摘要】 目的  探讨马鞭草提取液C部位对人绒毛膜癌JAR细胞体外抑制作用。 方法  MTT法测定不同浓度C部位在不同时段对JAR细胞的增殖抑制率;HCG单克隆酶免定量法检测马鞭草C部位对JAR细胞分泌HCG的影响;透射电镜观察细胞超微结构变化。 结果  JAR细胞经马鞭草C部位作用后，细胞增殖抑制率随着时间的延长和浓度的增加逐渐增大，72h的40g/L剂量组抑制最明显，抑制率为65%;HCG分泌受到明显抑制，呈剂量和作用时间依赖性;马鞭草C部位可引起细胞数目减少并萎缩;电镜下见到明显的凋亡小体。 结论  马鞭草提取液C部位对人绒毛膜癌JAR细胞增殖及分泌HCG有明显抑制作用，并可诱导JAR细胞凋亡。

    关键词  绒毛膜癌 JAR细胞 马鞭草提取液 凋亡

    Inhibitory effects of the part C in alcohol extract of Verbena officinalis on

    human choriocarcinoma JAR cell line in vitro

    Zhang Liping，Zhu Jingtian，Xu Changfen，et al.Magang Hospital of Maanshan，Maanshan243000.

    【Abstract】 Objective To investigate the effect of the part C in alcohol extract of Verbena officinalis on hu-man choriocarcinoma JAR cell line.Methods JAR cells were determined in the proliferation-inhibition ratio of the part C with vary chroma during different period of time using MTT method.The productions of HCG were detected during different time;morphological changes of JAR cells were observed and lastly the changes of ultrastructure were observed in different action time.Results The inhibition rate of experimental groups was more than that in control group and increased according to increasement of time and concentration.In72hours40g/L，there was a significant control and its inhibition was65%.Verbena officinals C could significantly inhibit the productions of HCG and the inhibitories effect were dose-and-time-dependent.The incubated tumor cells were decreased in number and be-came atrophic when they were treated with the part C.Apoptosis body were observed in experimental model of JAR.Conclusion The part C in alcohol extract of Verbena officinalis is a highly effective antineoplastic agent to choriocar-cinoma cells，manifestating time-concentration effect and could induce apoptosis.

    Key words choriocarcinoma JAR cell alcohol extract of Verbena officinalis apoptosis

    马鞭草（Verbena officinalis L.）系马鞭草科马鞭草属植物，分布较广。其始载于《名医别录》，具有活血散瘀、截疟、解毒、利水消肿等功效，在我国的汉族、彝族、傣族等25个民族广泛使用。主要被用于治疗支原体肺炎、急性乳腺炎等许多炎症性疾病，还作为防治肾癌、前列腺癌、晚期肝癌的首选药物。近年来，关于中草药诱导肿瘤细胞凋亡的研究日益增多，它们以与其他化疗药物不同的作用机制受到人们的重视。马鞭草作为一种普通的中草药，已被证实具有兴奋大鼠离体子宫肌条的作用和抗早孕作用 ［1，2］ 。本研究室也已证明马鞭草醇提液对人绒毛膜癌JAR细胞具有特异性的抑制作用 ［3］ 。徐昌芬 ［4］ 等从醇提液中筛选出一有效C部位，并提示马鞭草可能诱导JAR细胞凋亡。本文就马鞭草C部位在体外对人绒毛膜癌JAR细胞抑制作用初步研究探讨如下。

    1 材料与方法

    1.1 材料 绒毛膜癌JAR细胞株由上海细胞生物学研究所提供，DMEM培养基（美国GIBCOL公司产品），胎牛血清由杭州四季青生物工程公司供应，马鞭草C部位由江苏省中医药研究所提取分离，每毫升含生药1g，无菌抽滤后用含10%胎牛血清的DMEM培养液稀释到所需浓度;溴化钾噻唑基四唑（MTT）为Fluka公司产品;HCG单克隆酶免定量检测试剂盒由中国协和医科大学基础所提供，HCG标准品为Sigma公司产品;CO 2 培养箱:Precision scientific，USA;日本OLYMPUS倒置显微镜;奥地利SUN ZISE酶标仪;EM-1010为日本日立公司产品，LKB-V超薄切片机。

    1.2 MTT显色法 JAR细胞以1×10 4 /ml活细胞数接种于3块96孔酶联板，每孔接种100μl，24h后对照组加入100μl DMEM培养液，加药组分别加入100μl含马鞭草C部位的培养液，终浓度为10g/L、20g/L、40g/L，每组设3复孔，加药后继续培养，于24h、48h、72h在相差显微镜下观察细胞生长情况。培养结束前4h，每孔吸去上清后加入100μl MTT，继续培养4h，弃全部上清，加入100μl0.04N盐酸异丙醇，微型混合器震荡溶解，于酶标仪波长570nm处测各孔吸光度值。以加药剂量为横坐标，增殖抑制率为纵坐标绘制相对生长曲线。细胞增殖抑制率=（1-加药组光密度值/对照组光密度值）×100%。

    1.3 HCG单克隆酶免定量检测 采用HCG单克隆酶免定量方法:（1）DMEM培养液调整细胞浓度为1×10 5 /ml，接种于96孔培养板，设3复孔。（2）选择对数生长细胞，24h后弃上清，实验组细胞加人200μl不同浓度马鞭草C部位（10g/L、20g/L、40g/L），对照组加等量培养液。（3）设3个时间段（24h、48h、72h），设定时间段收集上清，-20℃冻存待测HCG。（4）HCG标准品用培养液稀释成500IU/L、400IU/L、200IU/L、100IU/L、50IU/L5个浓度，用HCG酶标单克隆抗体试剂盒检测每个浓度的OD值（波长450nm），以HCG浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线。（5）待测液用上述方法测定OD值，根据标准曲线计算样品中HCG浓度。每组实验至少重复3次。（6）HCG分泌抑制率=（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值×100%。以作用时间为横坐标，抑制率为纵坐标绘制抑制率曲线图。

    1.4 透射电镜观察细胞超微结构变化 （1）用细胞刮棒收集实验及对照组细胞各约1×10 7 /ml;（2）2.5%戊二醛4℃前固定2h，PBS漂洗15min×4遍;（3）1%的锇酸4℃后固定2h，0.1MPBS洗1遍，蒸馏水洗1遍;（4）2%醋酸铀染色2h，室温放置;（5）50%、70%、90%、100%、100%丙酮室温下逐级脱水，各15min;（6）浸渍与包埋:丙酮与包埋剂1:1室温1.5h、丙酮与包埋剂1:2室温过夜及纯包埋剂37℃浸渍3h后用纯包埋剂包埋;（7）60℃聚合36h;（8）LKB-V超薄切片机切片（50～100nm），柠檬酸铅染色，透射电镜观察。

    1.5 统计学方法 用SPSS10.0进行统计学处理，各组之间比较用方差分析，P<0.05为差异有显著性。

    2 结果

    2.1 MTT法对细胞增殖抑制率的影响 马鞭草C部位呈剂量和时间依赖抑制体外培养的JAR细胞生长，随着时间与剂量的增加，增殖抑制率逐渐增高，总体方差分析结果显示不同时段各剂量组之间差异有显著性;与对照组比较，除低剂量组外，其余差异皆有显著性;组间比较，除24h低剂量组与中剂量之间，其余差异皆有显著性。以C部位40g/L组72h抑制作用最强，见表1。MTT显色法以作用时间为横坐标，增殖抑制率为纵坐标绘出不同浓度药液在不同时间作用于JAR细胞的相对生长曲线，见图1。

    2.2 马鞭草C部位对人绒毛膜癌JAR细胞分泌HCG的影响 见图2，马鞭草C部位对人绒毛膜癌JAR细胞分泌HCG有明显的抑制作用，以40g/L浓度抑制作用最明显，随着药物浓度与作用时间的延长，HCG的分泌逐渐下降，呈现时间和剂量依赖，见表2。

    表1 马鞭草C部位对JAR细胞的生长抑制作用 （略）注:与对照组比较， * P<0.01;与低剂量组比较， ▲ P<0.01

    表2 马鞭草C部位作用后JAR绒癌细胞HCG分泌量和抑制率 （略）注:与对照组比较， * P<0.05， ** P<0.01

    图1 细胞增殖抑制率与作用时间关系

    图2 HCG分泌抑制率与马鞭草C部位量效关系

    2.3 加入马鞭草C部位后人绒毛膜癌JAR细胞的形态学变化 透射电镜观察结果显示，对照组细胞核大，圆形或椭圆形，形态较规则，染色质分布均匀，核膜完整，边缘光滑，核仁明显，见图3。40g/L药物作用24h后，可见JAR细胞微绒毛减少，细胞核染色质开始向边缘聚集，内质网扩张，见图4。作用48h，染色质边聚显著，核中央电子密度降低，形态不规则，见图5。作用72h，内质网极度扩张、核糖体减少、胞质呈空泡状改变并可见凋亡小体及膜结构髓样改变，见图6、图7。

    3 讨论
   
    肿瘤的发生发展与细胞增殖失控、分化障碍及凋亡受阻密切相关，而机体细胞的稳态依赖于细胞增殖、分化和凋亡之间的动态平衡。绒毛膜癌是来源于胎盘滋养细胞的肿瘤，其特点是增生的滋养细胞失去原来绒毛或葡萄胎的结构，大片侵入子宫基层及血管，并早期可发生全身转移，以致患者迅速死亡 ［5，6］ 。近年来，发现细胞凋亡在肿瘤发生机制上起重要作用，诱导凋亡已成为肿瘤治疗研究中的一项重要课题。研究发现，大多数化疗药物都具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，但化疗药物的毒副作用限制了其临床应用，因而植物抗癌成分受到人们极大关注。马鞭草是一味普通的中草药，应用已有近千年的历史。本实验用MTT显色法，肯定了马鞭草C部位对体外培养的JAR细胞有明显的增殖抑制作用，并随剂量与时间的增加而不断增高，经统计学检验差异有显著性（见表1）;40g/L组在72h的增殖抑制率达到65%，提示大剂量马鞭草C部位药液可抑制人绒癌JAR细胞的生长。正常情况下，细胞增殖和凋亡维持了组织中细胞总数平衡。肿瘤组织因细胞过度增殖，凋亡相对抑制，从而造成机体的失衡状态，加速和促进肿瘤细胞凋亡对肿瘤防治具有重要意义。马鞭草对JAR细胞的这种抑制作用提示其可能诱导JAR细胞凋亡。本实验以绒毛膜癌JAR细胞为体外模型，还发现不同浓度马鞭草C部位对绒癌JAR细胞HCG分泌均产生抑制作用，呈时间及剂量依赖，以40g/L最为显著。HCG是由两种不同的分子组成的糖蛋白激素，它们不仅具有不同种类的肽，也具有不同的分子化合物和糖类。分泌HCG是绒癌细胞的特征，也是反映绒癌细胞功能与消长的重要指标。作为绒癌细胞的特征性标志物，HCG水平的高低在绒癌患者的诊断、疗效监测及预后判断都具有重要的价值。实验证明，磷酸三烷基酯化合物对于人胎盘分泌的HCG是一种有效的刺激物，胎盘存在对这种化合物潜在的作用靶器官，它们的内分泌紊乱效应将导致育龄妇女HCG和雌激素浓度的变化 ［7］ 。可能马鞭草C部位就含有此种化合物，它作用于绒癌JAR细胞使其功能发生变化，并进一步影响其生长。此外，透射电镜检测发现马鞭草C部位对细胞膜及线粒体的结构也产生影响。透射电镜观察显示线粒体变性，主要表现为线粒体肿胀、嵴断裂、髓鞘样变及基质高电子密度物质沉积，其他学者也有发现在细胞凋亡过程中线粒体肿胀的报道 ［8，9］ 。线粒体是细胞内一个重要的细胞器，是细胞进行呼吸链电子传递、三羧酸循环和氧化磷酸化的场所，是细胞的能量工厂，其病变影响到细胞各成分的协调并危及细胞的生命活动。马鞭草C部位可能是通过线粒体 途径诱发JAR细胞凋亡的，同时，线粒体变化及其引起的能量代谢障碍可能也与细胞的增殖抑制有关。透射电镜也观察到细胞超微结构发生典型的凋亡改变，见到明显的凋亡小体，结合报道马鞭草C部位将JAR细胞阻滞于G 2 /M期 ［10］ ;琼脂糖凝胶电泳见典型的“阶梯状”条带 ［11］ ，提示马鞭草C部位对绒癌JAR细胞的抑制作用是诱导细胞凋亡的过程。

    综上所述，笔者认为马鞭草C部位能抑制JAR细胞增殖和HCG分泌，并呈剂量和时间依赖性，马鞭草C部位对JAR细胞的作用是诱导细胞凋亡的过程，至于其具体的作用机制有待进一步探索。由于此次实验培养细胞中不含巨噬细胞、T细胞等免疫细胞，故可以认为马鞭草C部位具有直接的抗肿瘤作用，关于其作为直接抗肿瘤药物的临床治疗方案和疗效评价还需进一步研究。诱导凋亡是许多化学结构不同、作用靶点各异的抗肿瘤药物的共同途径 ［12］ ，马鞭草C部位对绒癌细胞功能和增殖的抑制，诱导凋亡作用，提示该药可能成为新型的治疗绒癌药物。（本文图3～7见封三）

    参考文献

    1 张涛，李万，阮金兰.马鞭草化学成分对大鼠离体子宫平滑肌条作用的研究.中国中医药科技，2001，8（5）:313.

    2 张涛，谢虹，李万.马鞭草提取物抗大鼠早孕作用实验研究.中国中医药科技，2001，8（1）:30.

    3 徐珊，焦中秀，徐小晶，等.马鞭草醇提液对绒毛膜癌JAR细胞增殖及表皮生长因子受体表达的影响.中国药科大学学报，2000，31（4）:281-284.

    4 徐昌芬，曾群，徐珊，等.马鞭草醇提液中有效部位的提取及筛选.交通医学，2003，17（5）:604.

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    9 Scarlett JL，Sheard PW，Hughes G，et al.Changes in mitochondrial mem-brane potential during staurosporine-induced apoptosis in Jurkat cells.FEBS Lett，2000，475（3）:267-272.

    10 张立平，罗莉，王家俊，等.马鞭草提取液C部位对人绒毛膜癌JAR细胞增殖的影响.南京医科大学学报，2004，24（5）:470-472.

    11 王家俊，罗莉，徐昌芬.马鞭草C部位抑制JAR绒毛膜癌细胞HCG分泌和诱导凋亡的研究.中华实用中西医杂志，2004，4（17）:2180-2182.

    12 Lucci A，Han TY，et al.Multidrug resistance modulators and doxoru-bicin synergize to elevate ceramide levels and elicit apoptosis in drug-resistant cancer cells.Cancer，1999，86（2）:300-311.

    （编辑新 竹）

    基金项目:江苏省自然科学基金资助项目（编号:BK2003104）
    作者单位:243000安徽省马鞍山市马钢医院
    210029南京医科大学