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【摘要】 目的 研究粉防己碱（tetrandrine，Tet)对去氧胆酸钠（sodium deoxycholate，SDOC)诱发的大鼠胰腺腺泡细胞损伤及核因子κB（NF-κB）活化的影响，以探讨Tet防治胆盐致胰腺腺泡细胞损伤的机制。方法 胶原酶法分离大鼠胰腺腺泡细胞，采用MTT法检测胰腺腺泡细胞的活性；免疫荧光染色检测NF-κB亚单位P65生成量和核易位；另外，提取核蛋白进行凝胶电泳迁移率测定NF-κB的DNA结合活性。结果 SDOC可以直接导致胰腺细胞损伤，呈时间依赖性。Tet可以减轻SDOC所致的细胞损伤，Tet可以抑制SDOC诱发的胰腺腺泡细胞内NF-κB活化。结论 Tet可以抑制SDOC诱发的胰腺腺泡细胞内NF-κB活化，从而发挥对胰腺腺泡细胞的保护作用。
【关键词】 粉防己碱；胆盐；胰腺；腺泡细胞；核因子κB
急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP)病势凶猛，发病机制错综复杂。近来，学者们研究发现胰腺腺泡细胞内钙超载在AP的发生、发展中具有重要的作用［1］。另外，核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB)作为一种转录因子是细胞因子产生的重要调节剂，NF-κB活化在炎症的级联效应中发挥重要的作用。早期阻断NF-κB的活化可以改善胆源性胰腺炎的存活率［2］。去氧胆酸钠（sodium deoxycholate，SDOC)是致炎性最强的胆汁成分，也是目前胆源性AP模型的成功诱导剂。在前期的实验中，我们发现SDOC能够直接诱发胰腺腺泡细胞NF-κB的活化，而钙离子络合剂依他酸（egtazic acid，EGTA)可以抑制SDOC诱发的NF-κB的活化，减轻它们所致的胰腺腺泡细胞损伤，提示Ca2+可能作为一个重要的信使在NF-κB活化、进而在胰腺腺泡细胞的损伤中发挥重要的作用，而阻断Ca2+的内流可以抑制NF-κB的活化，减轻细胞的损伤。
粉防己碱（tetrandrine，Tet)是中药防己的主要成分，乃一种天然的非特异性的钙通道拮抗剂（calcium channel blocker，CCB)，具有广泛的药理作用［3］。在以前的在体实验中［4］我们观察发现Tet可以通过抑制胰酶活化、减轻组织的过氧化损伤和炎症反应，改善去氧胆酸钠诱发的胆源性AP动物胰腺和肺的病理损伤、降低动物的死亡率。但Tet是否对胰腺腺泡细胞有直接保护作用及其具体机制，有待阐明。在本次实验中我们采用离体大鼠胰腺腺泡细胞，观察Tet是否对SDOC诱发的胰腺腺泡细胞损伤具有保护作用，并通过观测相关指标的变化，揭示Tet对SDOC诱发的胰腺腺泡细胞损伤的保护作用及机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 雄性SD大鼠由中科院上海实验动物中心提供（SPF级，合格证号SYXK 2002～0023），体重200～250g，实验前禁食12h。
1.1.2 主要试剂 去氧胆酸钠（Sigma公司）。粉防己碱，由第二军医大学药化所提供。四氮噻唑蓝［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-dipheny 1-2H-tetrazolium bromide，MTT］(Sigma公司）。NF-κB凝胶电泳迁移率检测试剂盒（Promega公司），含有Hela细胞核提取物、T4多聚核苷酸激酶、NF-κB寡核苷酸链、AP2寡核苷酸链。［γ-32P］ATP酒精水溶液（浓度为1μCi/μl)，购自上海同位素公司。兔抗大鼠NF-κB p65多克隆抗体（Santa Cruz公司）；FITC（fluorescein isothiocyanate，异硫氰酸荧光素）标记的山羊抗兔IgG（KPL公司）。
1.2 方法
1.2.1 胰腺腺泡细胞的分离 胶原酶法分离SD大鼠的胰腺腺泡细胞［5］。将细胞接种于含10%牛血清的Hepes缓冲液中孵育（细胞密度为：1×105/ml，胰腺腺泡细胞的纯度＞80%、存活率＞90%）。
1.2.2 细胞培养和处理 将胰腺腺泡细胞分别接种于24孔、96孔和3.5cm培养板中，CO2孵箱37℃孵育4h后，给予Tet（50μmol/L、100μmol/L）处理5min，再经SDOC（50μmol/L)或正常培养液分别孵育30min、1h、4h、10h。各组胰腺腺泡细胞经上述刺激剂作用至相应的时间后，逐步进行如下处理。
1.2.3 MTT测定 采用MTT测定法定量检测细胞的存活情况。细胞的活性与吸光度值（OD值）成正比。细胞的存活率采用对照组的百分比来表示，公式即：100%×OD490，LPS处理组/OD490，对照组（新鲜分离）。
1.2.4 NF-κB 免疫荧光检测 各组胰腺腺泡细胞经上述刺激作用至相应的时间后，逐步进行如下处理：（1）将细胞悬液滴加至经0.1%的多聚赖氨酸预处理的载玻片上，室温下孵育60min；（2）用新鲜配置的4%福尔马林磷酸盐缓冲液4℃固定细胞20min；（3）0.1%Triton X-100（wt/vol)磷酸盐缓冲液室温作用5min以增加细胞通透性；（4）用含1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（封闭液）室温下封闭30min；（5）1∶100兔抗大鼠NF-κB P65多克隆抗体室温孵育1h，阴性对照组仅用封闭液孵育；（6）1∶100 FITC标记的山羊抗兔抗体室温下孵育45min；（7）加盖玻片并封片后共聚焦显微镜下检测；（8）每一玻片任选5个视野，计数所扫描到的细胞总数及核阳染的细胞数，计算核阳染率。
1.2.5 NF-κB 活性的电泳迁移率检测（EMSA） 胰腺腺泡细胞经上述刺激剂作用至相应的时间后，细胞被收集提取核蛋白进一步采用EMSA检测NF-κB 的活性。（1）提取核蛋白：参照Steinle等［6］的方法并稍作改动提取核蛋白，以牛血清白蛋白作为标准品，采用Lowry法测定核蛋白提取物中的蛋白质浓度。（2）EMSA：采用EMSA法检测NF-κB 活性［7］。NF-κB 寡核苷酸探针含有NF-κB 的DNA结合区域，这个双链DNA探针的序列为5’AGT TGAGGG GAC TTT CCC AGG C 3’；3’TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G 5’(下划线处为NF-κB结合区）。采用T4多核苷酸激酶法以［γ32P］ATP标记NF-κB寡核苷酸链末端，即形成32P标记的双链寡核苷酸特异性探针。竞争性实验采用缺乏κB结合区域的不相关的寡核苷酸、AP2同序寡核苷酸作为非特异性探针。核蛋白提取物（5μg）与放射标记的探针在反应体系中共同孵育后，经7%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳2h（电压250V，电泳缓冲液为0.5×TBE），电泳后真空抽滤干胶，置-70℃放射自显影48h。
1.3 统计学方法 实验数据按照完全随机对照的要求收集、整理、建立数据库，采用Microsoft Excel 2000软件包进行统计处理，胰腺腺泡细胞核荧光的阳染率采用χ2检验；其余数据以（x±s）表示，采用单因素方差分析，P＜0.05示为差异有显著性，P＜0.01示为差异有非常显著性。
2 结果
2.1 Tet对SDOC所致的胰腺腺泡细胞损伤的保护作用 随着SDOC浓度的增加和作用时间的延长，细胞存活率逐渐下降，与同一时间点的对照组相比，差异有显著性（P＜0.05）。而Tet处理组（50μmol/L or 100μmol/L）的细胞存活率明显增加，与同一时间点SDOC组相比差异有显著性（50μmol/L，P＜0.05；100μmol/L，P＜0.01）。这一结果提示：Tet能够明显减轻SDOC所致的胰腺腺泡细胞的损伤（见图1）。
图1 Tet抑制SDOC诱发的胰腺腺泡细胞损伤 略
2.2 Tet和SDOC所诱发的胰腺腺泡细胞NF-κB的核易位 细胞在经正常培养液培养30min、1h及4h仅见胞浆的轻度染色，核染色少见。50μmol/L SDOC作用后胰腺腺泡细胞胞浆荧光染色增强、并可见到大量胰腺腺泡细胞出现核染色，1h核染色达高峰（核染色率＞90%）。Tet预处理胰腺腺泡细胞15min后，采用50μmol/L SDOC孵育30min、1h及4h，观察发现Tet预处理组，胰腺腺泡细胞浆荧光染色明显削弱，核染色率明显降低，与同一时间点SDOC组相比差异有显著性（P＜0.05）（见表1），提示：Tet能够明显减轻SDOC所诱发的胰腺腺泡细胞NF-κB核易位。
表1 Tet对SDOC诱发的胰腺腺泡细胞NF-κB核易位影响 （略）
2.3 Tet 干扰LPS及SDOC诱发的NF-κB活化 采用EMSA法检测不同浓度SDOC作用后NF-κB结合活性。胰腺腺泡细胞在未经刺激的状态下，NF-κB的结合活性几乎不能被检测到，50μmol/L SDOC刺激胰腺腺泡细胞1h和4h后，可见NF-κB的结合活性增加，在作用后的1h NF-κB结合活性最高。
预先给予50μmol/L Tet，观察其对SDOC诱发的胰腺腺泡细胞NF-κB活化的影响。实验发现在1h和4h，Tet可以显著抑制SDOC所诱发的NF-κB活化。
3 讨论
AP的发病机制错综复杂，有多个病理环节参与AP的发生、发展。胰腺腺泡细胞钙超载在AP发病机制中的作用日益受到重视［8］。Ca2+超载不仅是急性胰腺炎的多个发病环节之一，而且作为急性胰腺炎发病机制中的枢纽通过作用于其他诸个发病环节而促进AP的进程［9］。
Tet是中药粉防己的主要活性成分，化学结构属双苄基异喹啉类化合物。是一种天然的非特异性的钙离子通道拮抗剂，能够阻滞质膜电压或受体依赖性Ca2+通道，抑制细胞外Ca2+内流和细胞内Ca2+动员，维持细胞内钙稳态，保护肝细胞、心肌细胞、神经细胞等免受毒物及缺血再灌注损伤［10］。
在本次实验中我们采用离体大鼠胰腺腺泡细胞，观察发现SDOC作用后能够诱发胰腺腺泡细胞NF-κB的活化、促进NF-κB从细胞质移位到细胞核。而Tet减少SDOC所诱发的胰腺腺泡细胞NF-κB的核易位，干扰NF-κB活化，可能与Tet抑制了细胞内钙超载有关，Ca2+作为一个重要的信使参与NF-κB活化、钙超载是NF-κB活化的信号通路中的关键环节［11］。而阻断胰腺腺泡细胞钙超载可能会阻止ⅠκB的磷酸化降解，使NF-κB不被解离，而无法进入细胞核与炎性细胞因子等靶基因的κB位点发生特异性结合，使得炎性细胞因子的基因转录减少［12］，从而减轻胰腺腺泡细胞的炎症反应性损伤。Tet可能通过阻止SDOC诱发的胰腺腺泡细胞内P65核易位、降低NF-κB的DNA结合活性，而减轻SDOC所致的细胞损伤，对SDOC作用下的离体胰腺腺泡细胞有直接的保护作用，从而为未来采用Tet治疗AP、减轻AP时胰腺组织的病理损伤提供了直接的实验依据。
【参考文献】
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12 Han B， Logsdon CD. CCK stimulates mob-1 expression and NF-B activation via protein kinase C and intracellular Ca2+. Am J Physiol Cell Physiol，2000，278：C344-C351.
作者单位：1 712046 陕西咸阳，陕西中医学院基础部
2 200065 上海，同济大学医学院
(编辑：江 宇)