参麦注射液对缺氧复氧致鼠大脑皮层神经细胞Bcl-2/Bax蛋白表达的影响

    【摘要】  目的  研究参麦注射液对缺氧复氧致鼠大脑皮层神经细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。方法  取体外原代培养6天的小鼠大脑皮层神经细胞,置于95% N2和 5% CO2的缺氧罐中造成神经细胞不同时间的缺氧复氧。用免疫组织化学法显示缺氧复氧不同时间Bcl-2、Bax蛋白的动态表达，并进行了形态学观察。结果  单纯缺氧复氧组缺氧 8h复氧18h后，可见部分细胞核固缩，同时伴有染色质凝聚及核碎片出现，呈细胞凋亡的典型核形态特征。参麦注射液处理组,缺氧8h复氧18h后，出现核固缩的细胞数目明显减少，大多数细胞核形态正常；缺氧复氧后,大脑皮层神经细胞Bcl-2表达明显减弱，Bax表达明显增强，参麦注射液处理组与单纯缺氧复氧组相比，Bcl-2表达明显增强，Bax表达明显减弱。结论  参麦注射液对小鼠大脑皮层神经细胞缺氧复氧性损伤具有保护作用,而调控Bcl-2 /Bax蛋白表达可能是其重要机制之一。

　　【关键词】  参麦注射液；缺氧复氧；神经细胞培养；Bcl-2/Bax
   
　　Protective effects of Shenmai injection on protein Bcl-2/Bax in mouse cortical neurons injury induced by hypoxia/reoxygenation

　　CHEN Bing-pu, HUANG  Rui-ya,LI  Pei-chun,et al.

　　Department of Anatomy, Youjiang Medical College for Nationality,Baise 533000,China

　　【Abstract】  Objective  To study protective effects of Shenmai injection on protein Bcl-2 /Bax in mouse  cortical neurons injury  induced by hypoxia/reoxygenation.Methods  The mouse cortical neurons was cultured  for 6d, and placed in an anoxia chamber with  95% N2 and 5%CO2 to induce hypoxia/reoxygenation.Phase-contrast microscopy was used to observe morphological characteristics and immunohistochemistry was used to identify neurons.The dynamic expression of Bcl-2 and Bax protein at different H/R time was investigated with immunohistochemical method.Results  Nuclei in neurons treated by single H8R18 were partially shrunken and compacted with condensed chromatin. In contrast, the number of it treated by Shenmai injection were reduced,and the most was normal. The expression of  protein Bcl-2 decreased while the expression of  protein Bax increased following single H/R.After treated by Shenmai injection , the expression of  protein Bcl-2 increased while the expression of  protein Bax decreased.Conclusion  Shenmai injection  could  effectively  protect  the nerve cell from  injury induced by hypoxia/reoxygenation,and one of  mechanism for Shenmai injection  could be adjust the expression of protein Bcl-2 and Bax.

　　【Key words】  Shenmai injection；hypoxia/reoxygenation；nerve cell culture；Bcl-2/Bax

    缺氧缺血性脑疾病是当前危害人类生命和健康的主要疾病之一，一直是基础研究和临床诊疗关注的热点。大量研究证实缺氧缺血性脑损伤存在细胞凋亡现象。目前对神经细胞凋亡的研究虽已取得了很大进展，但仍有许多未知领域；而抗脑缺氧缺血性脑损伤后神经细胞凋亡的中医药研究刚刚起步。参麦注射液为古方生脉散之衍变方，近年来临床上广泛用于抗休克、抗心、肝、脑等重要器官损伤，疗效肯定。实验研究发现参麦注射液能显著提高大鼠局灶性缺血再罐注损伤时的血流量，减轻氧自由基对脑血管的损伤［1］。Bcl-2家族是目前研究得较为深入的与细胞凋亡密切相关的基因,而参麦注射液对缺氧复氧致神经细胞凋亡是否有直接的保护作用，文献鲜有报道。本文采用原代培养的小鼠胎鼠大脑皮层神经细胞缺氧复氧病理模型，观察参麦注射液对神经细胞Bcl-2/Bax蛋白表达的影响，探讨其脑保护作用，为临床应用提供实验依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物  孕16～18天的昆明小鼠（广西医科大学实验动物中心提供），取胎鼠做皮层神经细胞原代培养。

　　1.2  试剂和仪器

　　1.2.1  主要试剂  热灭活胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、L-谷氨酰胺（L-glutamine）及高糖型DMEM培养基购自GIBCO-BRL公司；兔抗鼠神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillate acid protein,GFAP)多抗、兔抗Bcl-2和Bax抗体、SABC试剂盒和DAB显色试剂盒均购自北京中山公司；DNA染料Hoechst 33258购自Sigma公司；参麦注射液：由人参、麦冬组成，每支10ml,含生药各1g,购自正大青春宝药业有限公司，生产批号：200205114；阿糖胞苷购自上海华联制药有限公司，生产批号：20010904；其他均为国产分析纯试剂。

　　1.2.2  主要仪器  倒置相差显微镜（leica）;解剖显微镜（重庆光学仪器厂）；CO2培养箱（TC 2323，Shel-lab,USA）;净化工作台（SW-CJ-1D，苏州安泰空气技术有限公司）；UV-265紫外可见分光光度计（SHIMADZU，Japan）;DG3022A酶联免疫检测仪（国营华东电子管厂）；台式离心机（TD4A型，湖南仪器仪表总厂）；氮气、二氧化碳、空气混合器（长沙长锦应用技术研究所）；35mm一次性培养皿、96孔培养板（falcon,USA）;75μm尼龙筛网（NITEX）。

　　1.3  小鼠大脑皮层神经细胞原代分离培养  大脑皮层神经细胞原代培养根据Choi DW的方法略加改进［2］。将受孕16～18天的昆明小鼠断颈处死,于无菌条件下剖腹取出胎鼠置于预冷DMEM的60mm培养皿中,于20×解剖显微镜下取出全脑置于另一含预冷DMEM的60mm培养皿，用显微手术镊分出两侧大脑皮层并仔细剥除脑膜和血管等纤维成分,用眼科剪剪成约1mm3的小块，然后加0.25%的胰蛋白酶,在37℃、5%CO2培养箱中振摇消化15min,用含有10%FBS的DMEM终止消化并移至15ml的离心管中，用尖端光滑吸管反复吹打，直至组织块分散。离心1200rpm×5min。弃上清液，加入含10%FBS的DMEM重悬细胞，用吸管反复吸吹至细胞完全分散。将细胞悬液经75μm尼龙筛网,收集细胞,计数。将细胞接种于预先用0.01%左旋多聚赖氨酸处理过夜的35mm无菌塑料培养皿中,每皿2ml,细胞接种密度为1×106个/ｍｌ。将细胞置于37℃、5%CO2培养箱中培养。接种培养基成分为90%高糖DMEM、10%FBS、2mM-谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素。种植24h后全量换培养液，第3天加阿糖胞苷（4μg/ml），培养至第6天时进行缺氧复氧实验。

　　1.4  神经细胞缺氧复氧模型的建立  取培养6天的神经细胞，置一密封罐中通入95% N2和5%CO2并将密封罐置37℃恒温孵箱中孵育适当时间,取出测定有关指标,观察不同时间、不同给药浓度对培养神经细胞的影响。正常对照组加等量的D-hanks液孵育。

　　1.5  缺氧复氧时间的选择  将培养之细胞置密封罐中,分别于缺氧0h复氧0h（H0R0），缺氧2h复氧18h(Ｈ2Ｒ18),缺氧4h复氧18h(Ｈ4Ｒ18),缺氧6h复氧18h(Ｈ6Ｒ18),缺氧8h复氧18h(Ｈ8Ｒ18)观察细胞生长状态。

　　1.6  参麦注射液浓度的选择  在缺氧前1h以10ｍl/Ｌ的终浓度进行干预,缺氧复氧时间和方法同上，检测相关指标。

　　1.7  DNA染料Hoechst 33258染色  配Hoechst 33258储存液，浓度为0.1mg/ml,蒸馏水溶解,4℃避光保存；取各处理组的细胞去掉培养液，用新鲜配制的4%多聚甲醛（0.01MPBS配制）室温下固定30min；用预冷的PBS洗涤3次；悬液悬浮于1ml培养基（含10%牛血清）中，加入10μl的Hoechst 33258储存液,混匀；置于37℃温育10min；将细胞置于冰上冷却后，离心，去上清液；将细胞重悬于1ml的PBS中，然后涂片，在荧光显微镜下观察细胞核的形态。

　　1.8  Bcl-2和Bax蛋白表达的免疫组化染色方法  各处理组将生长有神经细胞的盖玻片取出后用预冷的PBS洗涤2次，冷甲醇固定20min,用SABC法进行免疫组化染色。过程如下：双蒸水浸泡盖玻片3min,PBS洗3×3min；滴加3%H2O2，室温5min,PBS洗3×3min；滴加正常工作血清封闭液，37℃孵育20min；吸去封闭液，滴加适当稀释的一抗（Bcl-2 1∶250；Bax 1∶250，0.01MPBS配制）37℃孵育1h,PBS洗3×3min；滴加生物素化二抗，37℃孵育30min，PBS洗3×3min；滴加SABC液，37℃孵育30min，PBS洗3×3min；DAB显色，镜下控制反应时间，双蒸水浸泡终止反应；常规酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察。阴性对照用PBS替代一抗，其余步骤相同。并作显微照相和在QUANTIMET970图像分析仪(Cambridge Instruments Company)上用光密度组件对有Bcl-2和Bax蛋白表达的神经细胞作平均光密度(OD)测定。每组每皿细胞按Z字顺序连续观察10个视野，每个实验组观察4皿细胞，实验重复3次。

　　1.9  统计学方法  采用统计分析软件SPSS 10.0进行统计学分析。实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组资料样本均数间的比较采用单因素方差分析，两两比较用Student-Newman-Keuls检验或Dunnett检验。检验水准α=0.05。

　　2  结果

　　2.1  参麦注射液对缺氧复氧致神经细胞损伤在形态学方面的影响  正常对照组神经细胞胞体饱满，细胞周围光晕明显，折光性强，突起完整；缺氧复氧组，缺氧2h复氧18h后，胞体变圆肿胀，胞内变性颗粒增多；缺氧4h复氧18h后，突起断裂收缩，核质界限不清；缺氧6h复氧18h后，部分细胞膜已不完整；缺氧8h复氧18h后，细胞损伤继续加重，突起少见，胞体混乱，破裂细胞增多。参麦注射液保护组，随着缺氧复氧时间的延长，可见部分细胞肿胀，胞内颗粒变性，部分细胞膜破裂。但大部分细胞胞膜完整，胞周光晕明显，突起尚存。

　　2.2  Hoechst 33258染色  在荧光显微镜下可观察到正常对照组细胞核较大，染色质呈均匀分布；单纯缺氧复氧组缺氧8h复氧18h后，可见部分细胞核固缩，同时伴有染色质凝聚及核碎片出现，呈细胞凋亡的典型核形态特征。参麦注射液处理组（10ml/L）,缺氧8h复氧18h后，出现核固缩的细胞数目明显减少，大多数细胞核形态正常。

　　2.3  参麦注射液对Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

　　2.3.1  参麦注射液对Bcl-2蛋白表达的影响  正常对照组中可见大量Bcl-2蛋白阳性的神经细胞。Bcl-2蛋白主要分布于神经细胞胞浆、突起及核膜中，呈棕黄色，细胞核不着色。在单纯缺氧复氧组中，随缺氧时间的延长，各组Bcl-2蛋白表达均较正常对照组弱，以缺氧8h复氧18h最为明显。经图像分析Bcl-2蛋白表达的平均光密度与正常对照组比较差异有显著性（P<0.05）,见表1。经参麦注射液处理（10ml/L）的培养细胞缺氧8ｈ和复氧18h后，Bcl-2蛋白表达较单纯缺氧8h复氧18h组增强，经图像分析Bcl-2蛋白表达的平均光密度与单纯缺氧8h复氧18h组比较差异有非常显著性（P<0.01），见表1。

　　2.3.2  参麦注射液对Bax蛋白表达的影响  Bax蛋白在正常对照组中表达较弱，在单纯缺氧复氧组中，随缺氧时间的延长，Bax蛋白表达增强，以缺氧8h复氧18h最为明显，经图像分析Bax蛋白表达的平均光密度与正常对照组比差异有显著性（P<0.05），见表1。经参麦注射液处理（10ml/L）的培养细胞缺氧8ｈ和复氧18h后，Bax蛋白表达较单纯缺氧8h复氧18h组弱，经图像分析Bax蛋白表达的平均光密度与单纯缺氧8h复氧18h组比差异有非常显著性（P<0.01），见表1。表1  参麦注射液对缺氧复氧神经细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响（略）

　　3  讨论

　　3.1  对细胞形态学变化的影响  在形态学上特别是细胞核的形态变化为凋亡的最典型的特征，也是判断凋亡的最基本、最直接的指标之一［2］。凋亡的主要形态学变化包括细胞体积缩小、细胞核染色质固缩、凝聚在核膜周边形成月牙形、斑块状；核膜皱缩，内质网扩张，细胞膜表面发泡。对神经细胞而言，除了有上述的形态学改变外，还有突起回缩、短裂等表现［3］。根据凋亡细胞的形态学特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法，如普通光学显微镜观察、电镜观察、荧光显微镜观察和流式细胞分析等。本实验采用普通光学显微镜、荧光显微镜观察（DNA染料Hoechst 33258染色）方法，证实了参麦注射液(5～20ml/L)对缺氧复氧致鼠大脑皮层神经细胞凋亡在形态学方面有改善作用。

　　3.2  参麦注射液对神经细胞缺氧复氧Bcl-2、Bax蛋白表达的影响  脑缺血再灌注损伤可导致神经细胞的凋亡与坏死，是一个复杂的病理生理过程。由于凋亡是一个严格控制的、有序的死亡过程，因此凋亡过程中必须有一系列基因的参与和调控，是一个级联式基因表达的结果。参与凋亡过程的基因调控机制目前仍未完全清楚。调控细胞凋亡的基因主要有2类：一类是能诱导凋亡的基因如Bax、P53、c-myc等，另一类是能抑制细胞凋亡的基因，如Bcl-2等。基因调控特征是凋亡细胞的独特特征，有的研究者甚至认为它是判断凋亡的最好特征［4］。因此，在细胞死亡过程中是否有这些基因的参与，以及阻断这种凋亡特有的调控系统是否能影响细胞的死亡状况，可以作为区分凋亡与坏死的标准。Bcl-2家族是目前研究得较为深入的与细胞凋亡密切相关的基因。Bcl-2家族包括Bcl-2、Bcl-x-long、Bcl-x-short和Bax等。其中Bcl-x-long与Bcl-2功能相同，抑制细胞凋亡的发生；而Bcl-x-short及Bax则与其功能相反，主要是促进细胞凋亡，即在Bcl-2家族中Bax与Bcl-2的作用是相拮抗的。当Bcl-2过量时，形成Bcl-2同源二聚体，细胞受到保护；当Bax过量时，形成Bax同源二聚体，细胞则趋向死亡；Bcl-2与Bax结合形成异源二聚体可通过抑制细胞凋亡启动过程达到保护细胞的作用［5］。Bcl-2和Bax二者之间的比率决定着Bcl-2与Bax是形成Bcl-2/Bax异源二聚体还是Bax/Bax或Bcl-2同源二聚体，对于细胞是否接收诱导凋亡的信号，是否进入凋亡状态极为重要。

　　本实验通过免疫组织化学方法检测了参麦注射液对缺氧复氧损伤后神经细胞Bcl-2及Bax表达水平的影响。结果显示，参麦注射液10ml/L对凋亡相关蛋白的表达有调控作用，既对抑制凋亡的Bcl-2的表达有上调作用，同时又使促进凋亡的Bax的表达下调。使Bcl-2与Bax的比例在各时间点均大于1，即Bcl-2抑制凋亡的作用占主导地位。这可能是参麦注射液抗缺氧复氧性神经细胞凋亡作用的一个重要机制。

　　【参考文献】

　　1  韩前芬，马玉亭，韩决.参麦注射液对缺血再灌注兔的保护作用.中国病理生理学杂志，2000，16（7）：663-664.

　　2  Choi DW,Maulucci-Gedde M,Kriegstein AR.Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture.J Neurosci,1987，2:357.

　　3  Ittman RN,Wang S,Dibenedetto AJ,et al.A system for characterizing cellular and molecular events in programmed neuronal cell death.J Neurosci，1993，13:3669-3880.

　　4  Numate A,Takahashi C,Ito Y,et al. Communesins,cytotoxic metabolites of a fungus isolated from a marine alga.Tetrahedron Lett，1993，34(14): 2355.

　　5  Ltvai IN,Milliman CL,Korsmeyer ST. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolong,bax,thataccelerates programmed cell death. Cell，1993，74:609.

　　作者单位：1 533000 广西百色，右江民族医学院解剖学教研室

　　　　　　　2 533000 广西百色，右江民族医学院附属医院神经内科

　　(编辑：于  伽)