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［摘要］ 目的 观察富勒烯抗HSV-1的药效。方法 以逆相蒸馏法合成了富勒烯脂质体，用药物对病毒所致细胞病变的抑制实验以及病毒的空斑减数实验，观察C60脂质体对HSV-1F株的直接杀灭、感染阻断及增殖抑制作用。结果 在Vero细胞系统中，C60在光照及避光条件下，对HSV-1F株均具有直接杀灭和感染阻断作用，不具有增殖抑制作用。在光照条件下，对HSV-1F株直接杀灭的ED50、ED90分别为0.05313 μg/ml、0.1696 μg/ml；感染阻断的ED50、ED90依次为0.9461 μg/ml、5.643 μg/ml。在避光条件下，对HSV-1F株直接杀灭的ED50及ED90分别为12.90 μg/ml和26.20 μg/ml；感染阻断的ED50和ED90依次为24.13 μg/ml以及32.06 μg/ml。光照1 h，C60脂质体对Vero细胞的细胞毒为154.9 μg/ml。C60脂质体浓度为16.86 μg/ml及33.72 μg/ml时，对HSV-1F株直接杀灭的空斑减数率与光照时间成正相关，相关系数r分别为0.8510（P<0.005）和0.9766（P<0.005）；当C60脂质体浓度为16.86 μg/ml时，对HSV-1F株感染阻断的空斑减数率与光照时间正相关，相关系数r依次为0.84（P<0.005）及0.9923（P<0.005），说明C60的抗病毒作用具有时间效应，主要是光敏动力学机制起作用。结论 在光照条件下，C60对HSV-1F株直接杀灭及感染阻断的治疗指数分别为2915和163.7，C60抗HSV的作用值得进一步研究。
［关键词］ 富勒烯C60；I型人类单纯疱疹病毒；抗病毒
Effect research of antiherpes simplex virus type-1 of nanometer carbon fullerene C60 liposome
WANG Zhi-jie，YANG Zhan-qiu，HUANG Qi-shan，et al.Virus Research Institute of Medical College of Wuhan University，Wuhan 430071，China
［Abstract］ Objective To observe the effects of antiherpes sumplex virus type-1 with fullerene C60.Methods We prepare the fullerene C60 liposomes using reversed phase distillation method，examine the direct virucidal activity，infection block and multiplication inhibition of C60 liposomes to HSV-1F strain，using inhibition experiment of cellular pathologic effect of virus and plaque reduction assay.Results In Vero cell system，under lucifugal and illumination conditions，fullerene C60 has direct virucidal activity and infection block effect，but it does not has any multiplication inhibition action to HSV-1F strain.Under illumination condition，the ED50 and ED90 of direct virucidal activity of C60 to HSV-1F strain are 0.05313 μg/ml and 0.1696 μg/ml respectively，and the ED50 and ED90 of infection block action of C60 are 0.9461 μg/ml and 5.643 μg/ml separately.Under lucifugal condition，the ED50 and ED90 of direct virucidal activity of it to HSV-1F strain are 12.90 μg/ml and 26.20 μg/ml separately，the ED50 and ED90 of infection block action of it to HSV-1F strain are 24.13 μg/ml and 32.06 μg/ml respectively.After light radiation time of one hour，the IC50 of cytotoxicity of C60 liposomes is 154.9 μg/ml.During the concentration of C60 liposomes are 16.86 μg/ml and 33.72 μg/ml separately，the plaque reduction rate of direct virucidal activity to HSV-1F strain is positive correlation to the time of light radiation，the correlation coefficients rate 0.8510（P<0.005） and 0.9766 （P<0.005） respectively.When the concentration of C60 liposomes is 16.86 μg/ml，the plaque reduction rate of HSV-1F strain is also positive correlation to the time of light radiation，the correlation coefficients hare 0.84（P<0.005） and 0.9923（P<0.005） separately，which suggests the antiherpes activity of C60 has time effect，and C60 functions through photodynamic mechanism principally.Conclusion Under illumination condition，the treatment indices of C60 of direct virucidal activity and infection block to HSV-1F strain are 2915 and 163.7 respectively，the antiherpes function of C60 is worth to research deeply.
［Key words］ fullerene C60；human herpes simplex virus type-1；antiviral
富勒烯是由多个碳原子组成的稳定原子簇，是碳元素的第二种固体形式，也是一种纳米分子。Friedman SH发现C60与人类Ⅰ型艾滋病毒（HIV-1）蛋白水解酶（HIVP）的活性部位相互作用，对HIVP产生竞争性抑制［1］。后来的多项研究证实了C60的确具有抗HIV作用。Kasserman F和Kemp F［2］观察到C60对披膜病毒科西门利启森林甲病毒和弹状病毒科的水疱性口膜炎病毒有抑制作用。Lin YL［3］发现富勒烯的丙二酸衍生物C3可以使Ⅱ型登革热病毒、日本脑炎病毒失活，这种作用发生在病毒的吸附及穿透期。HSV-1可引起唇疱疹、疱疹性角膜结膜炎等疾病，眼部疾病严重时甚至会导致失明。HSV还可引起人类严重的中枢神经系统疾病，如脑炎、脑膜炎等［4］。有HSV原发感染的孕妇有可能发生母婴传播，引起新生儿脑炎、全身性播散性感染［5］以至于发生严重的后遗症，如偏瘫、智能发育迟钝（P<0.05），头颅B超异常（P=0.034），及脑干听觉诱发电位异常（P=0.023）［6］，还可引起新生儿的吸入性肺炎、肺出血［7］以及食管炎等。为了克服C60不溶于水的问题，我们用逆相蒸馏法制备了富勒烯脂质体，并且在绿猴肾细胞（Vero）系统中检测了富勒烯抗HSV-1F株的药效。现在将实验结果报告如下。
1 实验材料
1.1 药品和仪器 大豆卵磷脂（批号001103）——上海源聚生物科技有限公司，胆固醇（批号008214）——中国医药集团上海试剂公司进口分装。旋转式蒸发仪——上海亚荣生化仪器厂。紫外扫描仪（岛津UV-200型）、H66205超声波清洗仪（无锡超声电子设备厂），富勒烯C60纯品（纯度>99.9%）——武汉大学三维碳簇材料有限公司，其他试剂均为分析纯。
1.2 细胞和病毒 Vero细胞购自武汉大学典型培养物保藏中心。HSV-1F株由本所冻存于液氮罐中，HSV-1F株的半数组织感染剂量（TCID50）为109/0.1 ml。
2 方法
2.1 富勒烯脂质体的制备 以进口的电子天平精确称取12~15 mg富勒烯，充分溶解于17~18 ml甲苯中。称取1∶1（摩尔比）的卵磷脂和胆固醇，以3∶1（体积比）的氯仿和甲醇（如72 ml氯仿、24 ml甲醇）溶解，与富勒烯甲苯溶液在圆底烧瓶中均匀混合，在30 ℃以下用旋转式蒸发仪减压浓缩成均匀的脂质膜，放于真空干燥箱过夜，充分去除残留的有机溶剂。第二天早上，用50 ml乙醚、25 ml PBS（pH 7.0）将脂质膜溶解，在充氮气的条件下，超声处理30 min成均相，抽干乙醚，把剩下的水溶液挤压通过微孔滤膜，把未包封的富勒烯与脂质水溶液分开，得到均相黄棕色的C60脂质体。再用与杨新林、钱凯先等［8，9］相似的方法进一步去掉游离的富勒烯。以0.22 μm微孔滤膜过滤、灭菌，充氮气，保存于4 ℃冰箱待用。微孔滤膜烘干后，用甲苯萃取出游离的富勒烯，测其329 nm处的吸收峰，并与已知浓度的富勒烯甲苯溶液吸收标准曲线对照，得出游离的富勒烯含量，以求出包封率。
2.2 抗病毒的实验方法
2.2.1 常规培养 Vero细胞在含20%小牛血清的MEM培养液（均为Gibco公司产品）中生长，常规加入0.3 mg/L L-谷氨酰胺，青霉素100 mg/L，链霉素100 mg/L，以7.5%碳酸氢钠调pH。细胞维持液除含以上成分外，血清浓度为2.5%，待细胞长成完整单层时，加入病毒母液37 ℃吸附1 h，倒掉吸附液，加入细胞维持液，病变达80%左右时，冻融3次，用同型抗血清进行中和实验，鉴定无误后分装，-80 ℃保存待用。
2.2.2 抗病毒实验分组 当接种在10 ml培养瓶上的细胞长成完整单层后，用C60脂质体进行以下3组抗病毒实验。每组实验均设置正常细胞对照及单用病毒感染的对照。整个实验使用的感染复数（MOI）为1个空斑形成单位（PFU）/细胞：（1）药物对病毒的直接杀灭作用：病毒悬液与一系列含不同浓度C60脂质体的MEM培养液混合均匀，在避光及光照条件（40W荧光灯，距离为5 cm，每次照1 h）下，37 ℃水浴孵1 h，再感染细胞。吸附1 h后，用Hank’s液连续洗3次，加入细胞维持液，置37 ℃温箱孵育，每日观察细胞病变情况，48 h记录结果。（2）药物对病毒感染细胞的阻断作用：以一系列含不同浓度C60脂质体的MEM培养液预先与细胞在37 ℃孵育2 h，用Hank’s液连续洗3次后，将HSV-1种到细胞上，用避光及光照条件（光照条件同上）激活C60，以后的观察同上。（3）药物对病毒增殖的抑制作用：先以病毒感染细胞，吸附1 h后，以Hank’s液连续洗3次，加入含不同浓度C60脂质体的细胞维持液，结果的观察同上。
2.2.3 细胞毒性实验 此实验设立了正常细胞对照组及实验组。细胞在10 ml培养瓶中长成完整单层后，加入含不同浓度C60脂质体的MEM培养液，以40W荧光灯，距离为5 cm，光照1 h后以苔盼蓝拒染法检测细胞毒。
2.3 药效的观察方法
2.3.1 药物对细胞病变的抑制作用 经过以上3组抗病毒处理的细胞，37 ℃孵育24 h，弃维持液，加入1.0 ml PBS，冻融3次后，按对数比例稀释10-1~10-10，接种到细胞长成片的96孔板的孔中，每个样本接种4个小孔，吸附1 h后，以Hank’s液洗3次，37 ℃温箱孵育48 h，观察细胞病变，判定病毒滴度。
2.3.2 空斑减数实验 将经过以上3组抗病毒处理的细胞，孵育24 h，弃维持液，加入1.0 ml PBS，冻融3次后，接种到24孔细胞培养板细胞长成单层的孔上。吸附1 h，用Hank’s液洗3次后，加入含0.5%羧甲基纤维素（Sigma公司产品）的细胞维持液，孵育48 h，倒掉维持液。用10%甲醛固定30 min，再用0.5%结晶紫（20%甲醛配制）染色，计数空斑数，每次实验至少重复3次。空斑减数率（%）=（病毒对照组空斑数-药物实验组空斑数）/（病毒对照组空斑数）×100%。
2.3.3 药物的剂量效应和时间效应的观察 对C60的剂量效应的观察，即每组抗病毒实验均取7~9个C60脂质体浓度进行，再用细胞病变抑制及空斑减数实验观察，以加权直线回归求出ED50和ED90，观察随着C60脂质体浓度的增加，抗病毒药效是否增加，如果增加，则是有剂量效应。所谓时间效应，是由于C60具有需要光激发的特点，在抗病毒处理时变更光照时间，分别采用30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210 min、240 min、270 min光照，用直线相关观察病毒的空斑减数率与光照时间是否有直线相关，有直线相关的话，则是具有时间效应。
2.4 统计学方法 本实验抗病毒的半数效量ED50及细胞毒IC50，也就是剂量效应用加权直线回归法计算；时间效应用直线相关法处理。
3 结果
3.1 透射电镜检测结果 用透射电镜（JEM 100CXⅡ型）测得我们所制备的脂质体是单室脂质体，大小为28.7~100 nm（见图1~4）。实验包封率平均为80%左右。
图1 脂质体电镜照片（富勒烯脂质体）（放大7200倍） 图2 富勒烯脂质体电镜照片（放大10000倍） 图3 富勒烯脂质体电镜照片（放大14000倍） 图4 富勒烯脂质体电镜照片（放大36000倍）
3.2 C60脂质体对HSV-1F株的直接杀灭作用 在光照条件下，在细胞病变抑制实验中，11.24 μg/ml、14.05 μg/ml、16.86 μg/ml、19.67 μg/ml、22.48 μg/ml、25.29 μg/ml、28.10 μg/ml C60脂质体分别使HSV-1F株的TCID50对数下降了3log10、4log10、5log10、5log10、6log10、7log10、7log10；30.91 μg/ml浓度的C60脂质体可以完全抑制细胞病变。在避光条件下，11.24 μg/ml、14.05 μg/ml浓度的C60脂质体，对HSV-1F株的TCID50对数没有作用，也就是对HSV-1F株没有直接杀灭作用；但是16.86 μg/ml、19.67 μg/ml、22.48 μg/ml、25.29 μg/ml、28.10 μg/ml、30.91 μg/ml、33.72 μg/ml、36.53 μg/ml、39.14 μg/ml、42.15 μg/ml浓度的C60脂质体分别使HSV-1F株的TCID50对数降低了1log10、2log10、3log10、5log10、6log10、6log10、7log10；36.53 μg/ml以上剂量的C60脂质体可以完全抑制细胞病变。表1 C60脂质体对HSV-1F株的抑制作用（略）注：*C60脂质体的浓度单位为μg/ml从表1可见，在空斑减数实验中，C60脂质体直接杀灭HSV-1F株的ED50为0.05313 μg/ml，ED90为0.1696 μg/ml；在避光条件下，C60脂质体对HSV-1F株也有直接杀灭作用，ED50为12.90 μg/ml，ED90为26.20 μg/ml。在光照条件下，当C60脂质体的浓度固定在16.86 μg/ml，光照时间取30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210 min、240 min、270 min，检测HSV-1F株的空斑减数率时，用直线相关检验HSV-1F株空斑减数率与光照时间的关系，测得相关数r=0.8510（P<0.005）；当C60脂质体的浓度为33.72 μg/ml时，取以上的9个光照时间，则可测得HSV-1F株的空斑减数率与光照时间的相关系数r=0.9766（P<0.005）。以上的实验结果表明：（1）在光照及避光条件下，C60脂质体对HSV-1F株均具有直接杀灭作用，而且随着C60脂质体浓度的增加，对病毒所致的细胞病变的抑制，以及病毒空斑减数率也随之增加，说明C60对HSV-1F株的直接杀灭作用具有剂量效应。但是，在避光条件下，C60脂质体对HSV-1F株直接杀灭HSV-1F株需要非常大的浓度，其ED50和ED90分别是光照条件下ED50和ED90的243倍和154倍；（2）C60脂质体对HSV-1F株的直接杀灭具有时间效应，而且这种时间效应具有统计学显著性。
3.3 C60脂质体对HSV-1F株感染Vero细胞的阻断作用 在光照条件下，5.6 μg/ml、11.24 μg/ml、14.05 μg/ml、16.86 μg/ml、19.67 μg/ml、22.48 μg/ml C60脂质体使HSV-1F株的TCID50对数分别降低了3log10、4log10、5log10、6log10、7log10、8log10；在C60脂质体浓度超过25.29 μg/ml时，HSV-1F株的细胞病变被完全抑制。在避光条件下，5.6 μg/ml、11.24 μg/ml、14.05 μg/ml浓度的C60脂质体对HSV-1F株感染Vero细胞没有阻断作用；16.86 μg/ml、19.67 μg/ml、22.48 μg/ml、25.29 μg/ml、28.10 μg/ml依次使HSV-1F株的TCID50对数降低了1log10、5log10、5log10、6log10、7log10，C60脂质体的浓度超过30.91 μg/ml时，方可完全抑制HSV-1F株的细胞病变。空斑减数实验的结果测得，在光照条件下，C60脂质体阻断HSV-1F株感染Vero细胞的ED50为0.9461 μg/ml，ED90为5.643 μg/ml；在避光条件下，C60脂质体阻断HSV-1F株感染Vero细胞的ED50为24.13 μg/ml，ED90为32.06 μg/ml。而光照条件下，感染阻断的时间效应的检验，用16.86 μg/ml浓度的C60脂质体，仍然取30min、60min、90min、120min、150min、180min、210min、240min、270 min 9个点，用空斑减数实验检测HSV-1F株的空斑减数率，以直线相关检验两次实验的结果，测得光照时间与HSV-1F株空斑减数率的相关系数分别为r=0.84（P<0.005），r=0.9923（P<0.005）。这些实验结果揭示：（1）在光照及避光条件下，C60脂质体均具有阻断HSV-1F株感染Vero细胞的作用，而且随着C60脂质体浓度的增加，对病毒所致细胞病变的抑制，以及病毒空斑减数率也随之增加，说明C60脂质体对HSV-1F株的感染阻断作用具有剂量效应。但是避光条件下，ED50、ED90分别是光照条件下ED50及ED90的25倍和5.6倍。（2）C60脂质体在光照条件下，阻断HSV-1F株感染Vero细胞具有显著的时间效应，此效应具有统计学上的显著性。
3.4 C60脂质体对HSV-1F株增殖的抑制作用 近10次的重复实验均表明，不论是在光照条件下，还是在避光条件下，C60脂质体对HSV-1F株的增殖不具抑制作用。
3.5 C60脂质体的细胞毒作用 C60脂质体在避光条件下与Vero细胞孵育，没有发现明显的细胞毒作用，死细胞%<2%。在40 W荧光灯，距离为5 cm照射下，照30 min，细胞毒IC50为281.8 μg/ml，照1 h，细胞毒IC50为154.9 μg/ml。可见C60脂质体的细胞毒是光敏动力学机制在起作用。
4 讨论
本文报道了C60脂质体抗HSV-1F株的药效研究，所有的实验结果说明以下结论：（1）细胞病变的抑制实验和空斑减数实验均表明，在光照和避光条件下，C60脂质体对HSV-1F株具有直接杀灭作用，也可以阻断HSV-1F株对Vero细胞的感染，这两种作用均具有剂量效应。但是对HSV-1F株的增殖没有抑制作用。看来C60脂质体抗HSV-1F株感染的作用时间是在病毒进入细胞之前。（2）细胞病变的抑制实验和空斑减数实验也表明，在避光条件下，对HSV-1F株直接杀灭所需的ED50及ED90分别是光照条件下的243倍和154倍，阻断HSV-1F株感染Vero细胞的ED50及ED90依次是光照条件下的25倍和5.6倍。提示C60抗HSV-1F株主要通过光敏动力学机制，因为C60及其衍生物在紫外及可见光区均有较广的吸收，在光的激发下，C60很容易形成单线态（C601，生命期为1.3 ns），单线态经系统间过渡（intersystem crossing，ISC）成为三线态（C603，生命期为100 μs），产生单线态氧（1O2），起杀灭病毒的作用。但是还可能有其他机制。实验结果与Rudick CM［5］是一致的，他们发现加上3个丙二酸基团的C60衍生物C3，具有两极性的结构，可在Ⅱ型登革热病毒的吸附及穿透期通过与病毒被膜脂类的疏水性相互作用，使Ⅱ型登革热病毒和日本脑炎病毒失活。可能这是避光条件下，C60对抗有被膜病毒的另外一种机制。
评价药效的指标还有治疗指数（treatment index，TI）=IC50/ED50。C60光照Vero细胞1 h的细胞毒的IC50为154.9 μg/ml。在光照条件下，C60直接杀灭HSV-1F株的TI=2915；C60阻断HSV-1F株感染Vero细胞的TI=163.7。说明C60抗HSV的作用值得进一步研究、开发。
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*基金项目：国家自然科学基金资助项目（批准文号：30370069）
作者单位： 1 430071 湖北武汉，武汉大学医学院病毒研究所
2 310027 浙江杭州，浙江大学
3 430072 湖北武汉，武汉大学药学院
（编辑：宋 青）