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［摘要］ 目的 观察富勒烯抗HSV-1F株的可能机制。方法 用逆相蒸馏法合成了富勒烯脂质体，用HSV-1gC单克隆抗体T96对HSV-1F株感染的Vero细胞进行了间接免疫荧光染色，用流式细胞仪检测FITC染色阳性细胞%，观察感染早期（感染后24 h）C60脂质体对HSV-1F株gC的作用。结果 在Vero细胞系统中，C60脂质体在直接杀灭和感染阻断的实验中，不论在光照还是在避光条件下，对HSV-1F株gC的表达均有诱导作用;但是在增殖抑制实验中，对HSV-1F株gC的表达没有影响。在直接杀灭实验中，光照条件下，C60脂质体浓度与Vero细胞HSV-1F株gC染色阳性率正相关，r=0.9（n=7），P<0.001;避光条件下，r=0.6（n=7），P<0.05。在感染阻断实验中，光照条件下，C60脂质体浓度与Vero细胞HSV-1F株gC染色阳性率正相关，r=1.0（n=7），P<0.001;避光条件下，r=0.9（n=7），P<0.001。也就是说，C60脂质体浓度升高，Vero细胞HSV-1F株gC阳性率也升高，这是剂量效应。当C60浓度为17.69 μg/ml，随着光照时间的增加，Vero细胞HSV-1F株gC阳性率也随之增加，光照时间与HSV-1F株gC阳性率正相关，r=1.0（n=13），P<0.001。在感染阻断实验中，当C60浓度为11.20 μg/ml时，光照时间也与HSV-1F株gC阳性率正相关，r=0.8（n=6），P<0.01。指出C60对HSV-1F株gC的诱导具有时间效应。双因素方差分析表明，C60脂质体对HSV-1F株gC的诱导是光敏动力学机制在起作用。结论 与Vero细胞间接免疫荧光染色配套的空斑减数实验，揭示病毒的空斑减数率与HSV-1F株gC阳性率正相关，相关系数r具有统计学显著性。提示C60脂质体的抗病毒作用也许与其对HSV-1F株gC的诱导有关。
［关键词］ 富勒烯C60；间接免疫荧光染色；HSV-1F株糖蛋白gC；抗病毒机制
Primary research about the effect of nanocarbon fullerene C60 on the glycoprotein gC of HSV-1 F strain in early infection
WANG Zhi-jie，QU Xue-ju，WANG Yan，et al.
Virus Research Institute of Medical College of Wuhan University，Wuhan 430071，China
［Abstract］ Objective To investigate the mechanism of antiherpes simplex virus type-1 of C60.Methods We prepare the fullerene C60 liposomes using reversed phase distillation method，and make indirect immune fluorescent staining to Vero cells infected with HSV-1 F strain using mAbT96，which can recognize the epitopes on gC，with flow cell apparatus，we detect the positive percents of HSV-1F strain gC，and observe the effects of C60 liposomes on HSV-1 F strain gC in early infection（24 h post infection）.Results In Vero cell system，in direct virucidal and infection block experiments，fullerene C60 liposomes have induction effect on the expression of HSV-1F strain glycoprotein gC，whether it is under illumination or in lucifugal conditions，but in multiplication inhibition experiments，fullerene C60 liposomes have no effect to the expression of HSV-1F strain gC.In direct virucidal experiment，under illumination，the concentrations of C60 liposomes have positive correlation to the positive rate of HSV-1F strain gC in Vero cells.The correlation constant r=0.9（n=7），P<0.001.In lucifugal，r=0.9（n=7），P<0.001.In infection block experiment，in illumination，the concentration of fullerene C60 liposomes have positive correlation to HSV-1F strain gC positive rate in Vero cells，the correlation constant r=1.0（n=7），P<0.001.In lucifugal conditions，r=0.9（n=7），P<0.001.That is to say，when C60 liposome concentration increase，HSV-1F strain gC percents increase too.And this is dose response.When the concentratio of C60 liposomes are 17.65 μg/ml，with the increase of illumination times，the HSV-1F strain gCpositive rates of Vero cells increase also，the above both has positive correlation，r=1.0（n=13），P<0.001.We get the same results in infection block experiment，when the concentration of C60 is 11.2 μg/ml，the C60 concentration andthe positive rate of HSV-1F strain gC has positive correlation too，at this moment，r=0.8（n=6），P<0.01.All these results indicate that the induction of C60 liposomes to HSV-1F strain gC has time response.The double factors analysis of variance has showed that the mechanism of induction action of C60 liposomes to HSV-1F strain gC belongs to photodynamics effects，and which is the main mechanism.Conclusion The results of plaque reduction assays which are paired with indirect immune fluorescent staining of Vero cells，show that the plaque reduction rates have positive correlation to the positive rate to HSV-1F strain gC，all the correlation constants have significance in statistics.All above results suggest the antiviral effects of C60 liposomes may be relation to the induction to HSV-1F strain gC.
［Key words］ fullerene C60;indirect immune fluorescent staining;HSV-1F straingC；antiviral mechanism
1985年由Curl、Smalley和Kroto共同发现的C60，是碳的第三种固体形式，也是一种纳米分子。Friedman［1］发现C60和Ⅰ型人艾滋病病毒蛋白水解酶（HIVP）的活性部位相互作用，对HIVP具有竞争性抑制作用。Kasserman F和Kempt［2］用实验证明C60对披膜病毒科西门利启森林甲病毒和弹状病毒科的水疱性口膜炎病毒有抑制作用。而Lin等［3］则用C60的丙二酸衍生物使Ⅱ型登革热病毒和日本脑炎病毒失活，这种作用发生在病毒的吸附和穿透期。王志洁［4］对C60脂质体抗HSV-1F株药效的实验研究则表明:在Vero细胞系统中，C60在光照和避光条件下，对HSV-1F株均具有直接杀灭和感染阻断作用，不具有增殖抑制作用。这样的实验结果和Lin等［3］得出的结论是一致的，提示C60的抗病毒作用发生在感染早期。Ⅰ型单纯疱疹病毒（HSV）除可引起唇疱疹、疱疹性角膜结膜炎，严重时会引起失明外，还可引起脑炎、脑膜炎。如果患HSV原发感染的孕妇发生母婴传播，会引起新生儿脑炎、全身播散性感染，有严重的后遗症，如偏瘫、智能发育迟钝（P<0.05），头颅B超异常（P=0.034），脑干听觉诱发电位异常（P=0.023），还和新生儿的肺出血、食管炎等有关。因而疱疹病毒是人类必须攻克的病毒之一。HSV编码至少11种糖蛋白，大部分定位于毒粒被膜及感染细胞表面。HSV进入感染细胞的机制经过多年的研究，发现是一个复杂的过程。首先是毒粒与被感染细胞的表面结合。这种结合是由细胞表面的硫酸肝素蛋白聚糖与病毒被膜糖蛋白gC（或者还有gB）介导的。毒粒一附着到细胞表面的硫酸肝素上以后，HSV通过其gD与专一的受体结合，这些受体共有3种:（1）疱疹病毒进入介导者A（herpes virus entry mediator，HveA）;（2）nectin-1或HveC，也称为脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白-1;（3）3-O-磺基转移酶-3所修饰的硫酸肝素（HS）［5］协同gH、gL、gB使病毒被膜和细胞膜融合，病毒进入细胞。HSVgC在病毒感染中的主要作用一方面通过将毒粒吸附到宿主细胞表面的硫酸肝素上促进病毒进入，另一方面，还可以与宿主补体系统C3b结合，起免疫逃逸作用［6］。鉴于对C60抗HSV药效研究发现C60抗病毒作用主要发生在感染早期，而且作用机制似乎是阻碍病毒进入细胞，在研究C60抗HSV作用机制时，就选用了HSV-1gC作为实验的靶标，重点观察在感染早期C60对HSV-1F株gC的作用，进行了C60抗病毒机制的初步探讨，现在将实验结果报告如下。
1 材料
1.1 药品和仪器 大豆卵磷脂（批号001103，上海源聚生物科技公司）。胆固醇（批号008214，中国医药集团上海试剂公司进口分装）。旋转式蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。紫外扫描仪（岛津UV-200型）。H66205超声清洗仪（无锡超声电子设备厂）。富勒烯纯品（纯度>99.9%，武汉大学三维碳簇材料有限公司）。其他试剂均为分析纯。
1.2 细胞和病毒 Vero细胞购自武汉大学典型培养物保藏中心。HSV-1F株由本所冻存于液氮罐中。HSV-1F株的半数组织感染剂量（TCID50）为109/0.1 ml。
1.3 HSV-1 gC单克隆抗体 是www.abcam.com产品，批号为ab8230-T96。免疫原是HSV-1感染的Vero细胞抽提物，可识别gC。荧光标记的亲和纯化的羊抗小鼠二抗是同一公司的产品，批号为02-18-06，0.5mg包装。
2 方法
2.1 富勒烯脂质体的制备 以进口的电子天平精确称取富勒烯12～15 mg，充分溶于甲苯17～18 ml中，称取1∶1摩尔比的卵磷脂和胆固醇，以3∶1体积比的氯仿和甲醇溶解，与富勒烯甲苯溶液在圆底烧瓶中均匀混合后，在30 ℃以下用旋转式蒸发仪减压浓缩成均匀的脂质膜，放于真空干燥箱过夜，充分除去残留的有机溶剂。次晨，用50 ml乙醚、25 ml PBS（pH 7.0）将脂质膜溶解，在充氮气的条件下，超声处理30 min成均相，抽干乙醚，把剩下的水溶液挤压通过微孔滤膜，把未包封的富勒烯与脂质体水溶液分开，得到均相黄棕色的C60脂质体。再用与钱凯先、杨新林等［7］相似的方法进一步去掉游离的富勒烯，以0.22 nm微孔滤膜过滤、灭菌、充氮气，保存于4 ℃冰箱待用。微孔滤膜烘干后，用甲苯萃取出游离的富勒烯，测其329 nm处的吸收峰，并与已知浓度的富勒烯甲苯溶液标准吸收曲线对照，得出游离的富勒烯量，以求出包封率。
2.2 抗病毒的实验方法
2.2.1 常规培养 Vero细胞在含20%小牛血清的MEM培养液（均为Gibco公司产品）中生长。常规加入0.3 mg/L L-谷氨酰胺、青霉素100 mg/L、链霉素100 mg/L，以7.5%碳酸氢钠调pH。细胞维持液除含以上成分外，血清浓度为2.5%，待细胞长成完整单层时，加入病毒母液37 ℃吸附1 h，倒掉吸附液，加入细胞维持液，病变达80%左右，冻融3次，用同型抗血清进行中和实验，鉴定无误后分装，-80 ℃保存待用。
2.2.2 抗病毒实验分组 当接种到25 ml培养瓶上的细胞长成完整单层后，用C60脂质体进行以下三组抗病毒实验。每组实验均设置正常细胞对照及单用病毒感染的对照。整个实验使用的感染复数为1个空斑形成单位（PFU）/细胞：（1）药物对病毒的直接杀灭作用:病毒悬液与一系列含不同浓度C60脂质体的MEM培养液混合均匀，在避光和光照条件下（40 W荧光灯，距离为5 cm，每次照1 h）下，37 ℃水浴孵1 h，再感染细胞，吸附1 h后，用Hank’s液连续洗3次，加入细胞维持液，置37 ℃温箱孵育，24 h后进行间接免疫荧光染色，记录实验结果。（2）药物对病毒感染细胞的阻断作用:以一系列含不同浓度C60脂质体的MEM培养液预先与细胞在37 ℃孵育2 h，用Hank’s液连续洗3次后，将HSV-1种到细胞上，用避光及光照条件（光照条件同上）激活C60，以后的观察同上。（3）药物对病毒增殖的抑制作用:先以病毒感染细胞，吸附1 h后，以Hank’s液连续洗3次，加入含不同浓度C60脂质体的细胞维持液，以后的观察同上。
2.3 药效的观察方法
2.3.1 病毒感染细胞HSVgC阳性率的流式细胞仪检测 感染细胞的HSV-1F株gC染色基本上采用间接免疫荧光染色方法。在Vero细胞感染HSV-1 24 h后，将上清液用吸管移至离心管，并且以1500 rpm离心5 min，弃上清液，保留上清液中脱落的感染细胞。加入0.25%胰酶消化液到25 ml培养瓶中，将没有脱落的细胞消化下来，然后倒掉消化液，加入2 ml PBS，以吸管轻轻将细胞吹打下来，移入离心管中，1500 rpm 5 min。以含2%小牛血清白蛋白及0.1%叠氮钠的PBS（PBA）200 μl洗涤细胞，1500 rpm 5 min。用冷PBA以1∶700稀释HSV-1gC单抗T96 200 μl，加入到实验管中，对照管加入PBA 200 μl，吹打均匀，冰箱（4 ℃）孵育30 min，取出，同上离心，弃上清。以200 μl冷PBA洗1次，以去除多余的单抗。加入以PBA 1∶800稀释的FITC标记的羊抗小鼠IgG 200 μl，对照管加入200 μl PBA，吹打均匀，冰箱（4 ℃）孵育30 min，避光。冷PBA洗两次。将细胞重新悬浮在200 μl PBS中，吹打均匀，置流式细胞仪测试管中，以Beckman流式细胞仪（武汉大学医学院实验中心）检测HSV-1感染的Vero细胞的HSVgC阳性率。
2.3.2 药物剂量效应和时间效应的观察 对C60剂量效应的观察，是指每组抗病毒实验均取7～9个C60脂质体浓度进行，在感染后24 h做流式细胞仪检测HSV-1gC阳性细胞%，观察随着C60脂质体浓度的增加，HSV-1gC阳性%变化的情况。以确定C60脂质体是否具有剂量效应。所谓的时间效应，是由于C60具有光激发的特点，在抗病毒处理时变更光照时间，分别采用30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210 min、240 min、270 min光照，24 h后用流式细胞仪检测HSV-1gC阳性细胞%，观察光照时间是否与HSV-1gC阳性细胞%的变化相关，如果具有正相关关系，则有时间效应。
2.3.3 统计学方法 本实验抗病毒的剂量效应和时间效应均用直线相关法处理，并且用双因素方差分析对在光照及避光处理下HSV-1gC阳性细胞%的变化差异进行了分析。
3 结果
3.1 透射电镜检测结果 用透射电镜（JEM100CXII型）测得所制备的脂质体是单室脂质体，大小为28.7～100 nm（图1、图2），实验包封率平均为80%左右。
图1 － 图2 略
3.2 直接杀灭实验中C60脂质体对HSV-1F株gC表达的诱导作用 在光照直接杀灭实验中5.53 μg/ml、7.61 μg/ml、10.1 μg/ml、12.80 μg/ml、15.70 μg/ml、16.35 μg/ml、17.69 μg/ml、18.00 μg/ml、19.10 μg/ml C60脂质体，HSV-1F株gC染色阳性细胞%依次是5.84%、6.08%、8.01%、18.07%、39.22%、44.83%、48.22%、56.21%、58.28%（图3）;经过直线相关处理后，相关系数r=0.9（n=7），P<0.001。在避光直接杀灭实验中3.4 μg/ml、5.6 μg/ml、6.7 μg/ml、9.0 μg/ml、11.2 μg/ml、14.6 μg/ml、16.9 μg/ml、18.0 μg/ml、19.1 μg/ml C60脂质体，HSV-1F株gC染色的阳性细胞%分别是3.67%、5.53%、7.61%、11.76%、12.80%、16.84%、17.69%、21.62%、22.15%（图4）。经过直线相关处理后，相关系数r=0.6（n=7），P<0.05。以上的实验数据均表明，当C60脂质体浓度增加时，HSV-1F株gC阳性细胞%均增加，提示C60对HSV-1F株gC的表达有诱导作用。也可以看出在光照激活C60的条件下，HSV-1F株gC阳性细胞%增加的幅度更大。如果以光照及避光作为两个处理组，相同的脂质体浓度为单位组，进行双因素方差分析，处理组间变异的均方为1547.8，F=17.5，P<0.01。说明在光照条件下，HSV-1F株gC染色阳性细胞%增加幅度更大与光照对C60脂质体的激活绝对有关，因为光照和避光两种处理的差异具有显著性。在直接杀灭的时间效应观察中，当C60脂质体的浓度恒定在17.69 μg/ml时，将光照时间依次定为15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min、120 min、150 min、180 min、210 min、240 min、290 min时，HSV-1F株gC染色阳性细胞%依次为10.09%、12.48%、14.52%、14.59%、14.68%、15.62%、17.00%、19.42%、20.28%、29.43%、29.72%、40.14%、50.20%，对数据进行直线相关处理，相关系数r=1.0（n=11），P<0.001（图5）。指出C60脂质体对HSV-1F株gC表达的诱导也具有时间效应。
图3 － 图6 略
3.3 感染阻断实验中C60脂质体对HSV-1F株gC表达的诱导作用 在光照感染阻断实验中，当用浓度为3.4 μg/ml、4.5 μg/ml、5.6 μg/ml、9.0 μg/ml、10.1 μg/ml、11.2 μg/ml、14.6 μg/ml、15.7 μg/ml、16.9 μg/ml的C60脂质体与细胞预孵时，HSV-1F株gC染色阳性细胞%依次为5.78%、9.26%、9.76%、12.02%、14.17%、16.18%、17.36%、17.92%、22.93%。用直线相关处理，相关系数r=1.0（n=7），P<0.001（图6）。在避光感染阻断实验中，当用浓度依次为3.4 μg/ml、5.6 μg/ml、6.7 μg/ml、9.0 μg/ml、10.1 μg/ml、11.2 μg/ml、14.6 μg/ml、16.9 μg/ml、18.0 μg/ml、19.1 μg/ml的C60脂质体处理时，HSV-1F株gC染色阳性细胞%分别为0.67%、0.82%、0.84%、0.90%、0.92%、1.33%、1.33%、2.43%、3.59%、4.98%，当用直线相关处理时，相关系数r=0.9（n=8），P<0.001（图7）。以上的实验结果表明，C60脂质体对HSV-1F株gC的表达有诱导作用。在这种情况下，将光照及避光作为两个处理组，相同的C60脂质体浓度作为单位组，进行双因素方差分析，处理组间变异的均方为492.8，F=30.4，P<0.01。说明在光照条件下，HSV-1F株gC染色阳性细胞%增加幅度更大与光照对C60脂质体的激活的确有关，因为光照和避光两种处理的差异具有统计学显著性。在感染阻断时间效应的观察中，当C60脂质体的浓度恒定在16.35 μg/ml时，光照时间定在15 min、30 min、45 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min时，HSV-1F株gC染色细胞阳性率依次为3.59%、4.76%、9.47%、12.26%、13.55%、15.07%、20.72%、22.61%。对数据进行直线相关处理，相关系数r=0.8（n=6），P<0.01（图8）。指出C60脂质体对HSV-1F株gC表达的诱导也具有时间效应。
图7 － 图8 略
3.4 在增殖抑制实验中C60脂质体对HSV-1F株gC的表达不具诱导作用 在C60脂质体对HSV-1F株药效的实验研究中，经过近10次的重复实验表明，不论是在光照条件下，还是在避光条件下，C60脂质体对HSV-1F株的增加不具抑制作用。在经过抗病毒处理后，再对HSV-1F株感染的Vero细胞进行间接免疫荧光染色实验，实验结果发现在病毒已经进入细胞以后，再用C60脂质体处理，对HSV-1F株gC阳性细胞%的影响不大，或者说是没有任何影响。HSV-1F株gC细胞阳性率均与仅用病毒感染的对照接近，24 h时为6.08%～14.04%，表明C60脂质体在这种抗病毒处理条件下，对HSV-1F株gC细胞染色阳性率没有影响。
4 讨论
本文报道了在感染早期C60对HSV-1F株被膜糖蛋白gC作用的研究初探。以上流式细胞仪检测的图像及数据分析表明:（1）经过间接免疫荧光染色，C60处理过的HSV-1F株感染的Vero细胞gC阳性细胞%表明，不论是在光照条件下，还是在避光条件下，在直接杀灭和感染阻断实验中，C60对于HSV-1F株gC的表达均具有诱导作用。（2）不论是在直接杀灭实验，还是在感染阻断实验中，在光照条件下，C60比在避光条件下对HSV-1F株gC的诱导作用要强些，双因素方差分析提示这种差异是由于光照及避光的处理不同所致，不同处理的方差分析结果具有统计学显著性。表明C60对HSV-1F株gC表达的诱导与C60经过光照被激活有关。结合药效实验研究的结果考虑，C60抗HSV-1F株主要还是通过光敏动力学机制。因为C60及其衍生物在紫外及可见光区均有光泛的吸收。在光的激发下，C60很容易形成单线态（C601，生命期为1.3 ns），单线态经系统间过渡（intersystem crossing，ISC）成为三线态（C603，生命期为100 ns），生成单线态氧（O21），起杀灭病毒作用，但是可能还有其他机制。本研究最令人意外的发现就是C60脂质体会诱导HSV-1F株gC的表达。笔者在镜下可以看到C60脂质体似一层白色的膜铺在Vero细胞上，也许C60通过自身与HSV-1gC的结合阻断了病毒进入细胞。因为直接杀灭及感染阻断两种抗病毒处理方式实质上就是将病毒阻挡在细胞外，不让病毒进入细胞。在进行流式细胞仪对HSV-1F株gC间接免疫荧光染色阳性率检测的同时，笔者也做了配套的空斑减数实验，用直线相关处理发现，除了C60浓度分别与HSV-1F株空斑减数率及HSV-1F株gC染色阳性率相关外，将HSV-1F株空斑减数率与HSV-1F株gC染色阳性细胞%进行直线相关分析，两者也是相关的。在光照直接杀灭实验中，相关系数r=1.0（n=7），P<0.001;在避光直接杀灭实验中，相关系数r=1.0（n=7），P<0.01;在光照直接杀灭时间效应的实验中，相关系数r=0.8（n=7），P<0.01。在光照感染阻断实验中，相关系数r=0.9（n=7），P<0.005;在避光感染阻断实验中，相关系数r=0.9（n=7），P<0005;在光照感染阻断时间效应的实验中，相关系数r=0.9（n=6），P<0.005。以上结果全部具有统计学显著性。提示C60对HSV-1F株gC表达的诱导与C60抗这种病毒的机制肯定有关。HSV进入感染细胞是一个复杂的过程。首先是毒粒附着到被感染细胞的表面，这种结合是由细胞表面的硫酸肝素蛋白聚糖与病毒被膜糖蛋白gC（或者还有gB）介导的，毒粒一附着到细胞表面的硫酸肝素上以后，HSV通过其gD与专一的受体结合，这些受体共有3种:（1）疱疹病毒进入介导者A（herpes virus entry mediator，HveA）;（2）nectin-1或HveC;也称为脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白-1;（3）为3-O-磺基转移酶-3所修饰的硫酸肝素（HS）［5］协同gH、gL、gB使病毒被膜和细胞膜融合，病毒进入细胞。HSV gC在病毒感染中的主要作用一方面通过将毒粒吸附到宿主细胞表面的硫酸肝素上促进病毒进入，另一方面，还可以与宿主补体系统C3b结合，起免疫逃逸作用［6］。近年来对HSV细胞受体的研究还指出，gC是HSV-1附着到细胞上去的关键成分，这种附着是通过gC与硫酸肝素的结合完成的。据认为与氨基多糖结合是野生型HSV-1的特点［8］。用生物传感器的检测表明［6］gC对硫酸肝素的亲和力比gD对HveA和HveC 细胞受体的亲和力高，gC在HSV-1进入细胞中是一个关键的成分。通过C60脂质体对HSV-1F株gC作用的初探，可以肯定一点，C60的抗疱疹病毒作用与它对糖蛋白gC的作用有关。如果能够制备小鼠的富勒烯脂质体抗体，并且用不同于FITC（绿色）的荧光染料标记，然后用激光共聚焦显微镜对富勒烯脂质体对HSV-1gC的诱导作用进行观察，将有助于阐明其中的机制，我们希望下一步将对这些对富勒烯脂质体抗人类疱疹病毒机制进行研究，以便更为清楚地阐明富勒烯脂质体抗人类Ⅰ型疱疹病毒的机制。
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作者单位： 1 430071 湖北武汉，武汉大学医学院病毒研究所（△实验中心）
2 430072 湖北武汉，武汉大学药学院
（编辑：田 雨）