转化生长因子-β与肺纤维化

　　关键词  肺纤维化；转化生长因子；细胞因子

　　近年来,肺泡巨噬细胞及其他肺结构细胞合成的各种细胞因子如转化生长因子-β(transforming growth factor-beta，TGF-β),肿瘤坏死因子(tumor neciosis factor,TNF),血小板源性生长因子(platelete rived growth factor,PDGF),白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1) 等在肺纤维化机制研究中取得了非常重要的进展。有资料证明,TGF-β在肺纤维化的形成与发展中起关键性作用,本文对TGF-β在肺纤维化发病机制中的作用综述如下。

　　1  TGF-β家族

　　1.1  结构  TGF是DeLarco等1978年在小鼠肉瘤病毒转化的细胞株条件培养基中鉴定出的具有促进细胞生长和转化特性的物质。它包括TGF-α和TGF-β二种成分，是在分子组成﹑受体结构、生物学效应上都具有很大差异的二种不同蛋白家族。目前研究表明，TGF-α具有细胞转化作用，TGF-β是1983年Assoian等自人血小板中成功提取出来的，它是一个含30种以上蛋白成分的庞大家族—TGF-β超家族，包括不同形式的TGF-β、骨形成蛋白(BMP)、激活素、抑制素(inhibins)、苗勒抑制物和其他结构相关因子［1］。它们具有共同的结构、类似的信号转导途径和重叠的生物学效应。

　　TGF-β是一种多功能的多肽类细胞因子，几乎体内所有细胞都能分泌TGF-β并存在其受体，在细胞的生长调节中起重要作用。TGF-β是由二个结构相同或相近分子量为12.5kD的亚单位借二硫键连接而成的同源或异源二聚体碱性蛋白。它至少有5种异构体(TGF-β1～5)，在哺乳动物中表达并已克隆的是TGF-β1～3 。三者的序列同源性为70%～80%,并与TGF-β超家族的其他成员共同享有明显的序列同源性(30%)和7个保守的半胱氨酸区。TGF-β1～3的基因在人体细胞分别定位于第19、第1和第14号染色体，经转录翻译后成为大分子前体蛋白。活化型的TGF-β中有6个高度保守的半胱氨酸通过二硫键将几个β片层结构连接在一起，形成半胱氨酸的刚性结构，使TGF-β具有耐酸、碱、热和耐变性的特性［1,2］。

　　1.2  表达与调控  在参与肺纤维化的细胞因子中，TGF-β是最重要也是研究最为深入的细胞因子。只有活化的TGF-β才能发挥其生物学活性。它是以无活性的TGF-β前体分子形式分泌的，共价结合于潜活相关肽（latent associate peptide，LAP）和潜活相关的TGF-β结合蛋白（latent TGF-binding protein，LTBP）形成大复合物，结合于细胞外基质（extracellular matrix，ECM）发挥蛋白酶解作用［3］。

　　TGF-β超家族中，TGF-β1与肺纤维化的关系最密切。TGF-β1的编码基因位于19q13∶1染色体上,其分泌及作用的调节不仅决定于其本身在转录、翻译、分泌和释放环节的调控,还决定于TGF-β1受体的数量、类型及与环境和其他细胞因子间的相互作用,其表达调控受多因素影响。

　　1.3  功能  TGF-β由血小板、巨噬细胞、内皮细胞等产生，它能促进成纤维细胞趋化，产生胶原和纤维连接蛋白，抑制胶原降解，在组织器官的纤维化中发挥了十分重要的作用，被公认为纤维化形成与发展的启动枢纽，是关键性细胞因子。它是具有双重功能的细胞因子，其主要作用是抑制细胞生长和活性，但它可以促进间质细胞的增殖和功能，如促进成纤维细胞的增殖，增加成纤维细胞分泌纤粘素和胶原等细胞外基质等。在TGF-β家族中参与纤维化的主要是TGF-β1。它是一组具有多种生物学功能的蛋白多肽，对细胞的生长、分化和多种生理、病理过程起重要调节作用［4,5］。TGF-β1的生物学功能：①趋化并促进成纤维细胞分裂增殖及成熟分化。TGF-β1可以促进培养的间质细胞如成纤维细胞及成骨细胞的增殖，在人类成纤维细胞WI38，TGF-β1可以负调节p21的合成并激活周期素E-cd k2激酶活性。②刺激成纤维细胞大量合成胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型，尤其是Ⅳ型胶原蛋白，以增加肺间质的胶原成分，同时又抑制胶原蛋白酶及纤溶酶原激活物的合成，增加蛋白酶抑制物的形成，以减少肺间质ECM的降解，造成ECM调节失控。③抗炎作用TGF-β1可通过调节免疫系统来抑制B淋巴细胞和T淋巴细胞，同时通过NO产生对巨噬细胞的细胞毒性。④抑制细胞外基质自身的稳定。

　　1.4  受体与体内信号转导  TGF-β1发挥各种生物学调节功能依赖于其在细胞膜表面的特异性受体。目前发现三种有高亲和性与TGF-β特异结合的膜整合受体：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型受体（即TβRⅠ、TβRⅡ、TβRⅢ）。TGF-β受体必须同时与Ⅰ、Ⅱ型受体结合才能激活信号转导，而与单独一种受体结合是无效的。Ⅰ型受体又称为活化素受体样激酶（activin receptor like kinases，ALKs），分子量约为53kD。其结构分为信号肽、含大量Cys的亲水包外区、跨膜区和由激酶区与GS区共同组成的细胞内区四部分［6］，它近膜区的丝氨酸/苏氨酸激酶能被Ⅱ型受体以依赖配体形成磷酸化，它有高度保守的约30个氨基酸的GS区。GS区是受体激酶活性的作用区域，因富含独特的TSGSGSG序列而得名［7］。Ⅱ型受体是分子量约为75kD的糖蛋白，其结构分为信号肽、亲水包外区、跨膜区和由激酶区与22个氨基酸组成的、富含丝氨酸/苏氨酸的短尾共同组成的细胞内区四部分，它具有自我磷酸化功能。Ⅰ、Ⅱ型受体均为跨膜的丝氨酸/苏氨酸激酶受体。Ⅰ、Ⅱ型受体上的激酶区都是非常重要的，若二者都丢失会形成TGF-β信号转导的主要阻抑物，若丢失其中一个激酶区也足以阻断肺成纤维细胞中的肌腱蛋白和纤连蛋白的产生。Ⅲ型受体是一个分子量约为280～330kD大跨膜蛋白，它对信号转导无本质作用，主要是通过增加TGF-β与Ⅱ型受体的结合率，从而调节TGF-β与信号受体的结合［8］。

　　TGF-βs首先与相应的TβRⅡ相结合，再连接TβRⅠ共同形成TβRⅡ-TGF-βs- TβRⅠ异侧复合物。活化的TβRⅡ使TβRⅠ激酶磷酸化，激活TβRⅠ，活化的TβRⅠ可传递信号到下游的细胞内底物Smads，进一步完成TGF-βs信号转导至细胞核内过程，发挥TGF-βs的多种生物学功能。目前对TGF-β在细胞内Smad信号转导通路的研究较为深入［9］。在哺乳型动物中已发现8种Smad蛋白，分为3个亚型：①受体调解性Smad(R-Smad),包括Smad 1、2、3、5、8。②共同介导性Smad(Co-Smad)，是Smad 4。③抑制性Smad(I-Smad)，包括Smad 7。TβRⅠ特异识别磷酸化配体特异性受体活化的Smad（R-Smad）。R-Smad包括BMP下游分子Smad 1、5、8和TGF-β，激活素下游分子Smad 2、3。它们由二个MH区和一个连接区构成［10］。TGF-β1的其他信号转导途径有MKK4/SARK和MEK/ERK活化，其功能是正调控Smad途径。现已发现丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）通路参与TGF-β信号转导有二条［11］：c-Raf/MK1、2/ERK1、SEK1/MRK4、7/JNK和MEKK1/MKK3、6/p38。MAPK是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。研究表明，TGF-β活化的MAPK通路有很强的致纤维化效应。

　　2  TGF-β1促肺纤维化发生的机制

　　2.1  TGF-β1在肺纤维化过程中的表达  肺纤维化是肺组织的炎性损伤、组织结构破坏以及随后伴有肺间质细胞增生的组织修复过程。肺损伤早期均有肺泡炎表现，这种肺泡炎改变多认为是损伤因子导致肺泡壁毛细血管内皮通透性增加的结果，此期病理表现为血浆蛋白性渗出及巨噬细胞游出。研究发现，肺泡炎渗出液中有多种细胞生长因子，它们表达的种类、作用浓度和高表达的时间差异以及其相应受体激活程度，对肺泡上皮修复或肺纤维化的发生至关重要，其中TGF-β1是人们关注的热点之一。

　　在各种实验模型和临床纤维化疾病中，TGF-β1持续上升，抑制它的生物活性会抑制基质生成和调节纤维化过程［12］。关于TGF-β1在肺纤维化组织不同细胞成分中的分布及TGF-β1的主要来源、作用报道不一。Broekelmann用原位杂交法研究特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）患者的肺组织石蜡切片表明，TGF-β1mRNA主要表达在毗邻纤维病灶的肺泡巨噬细胞中，在病灶中只有微弱表达，而免疫组化提示，TGF-β1主要位于纤维化病灶区，而临近的肺泡巨噬细胞几乎看不到［13］，说明TGF-β1主要由肺泡巨噬细胞合成，分泌至纤维病灶区发挥作用。Khalil等［14］提示大鼠肺组织mRNA TGF-β1表达和TGF-β1蛋白质水平升高的重要细胞来源之一是肺泡巨噬细胞。IPF患者中，巨噬细胞有较高的TGF-β mRNA表达，并且TGF-β产生的部位和肺组织中异常细胞外间质的沉积部位一致。结果说明，在肺纤维化过程中TGF-β1和它的激活形式有重要意义。Zhang等应用博莱霉素诱导的肺纤维化模型研究了TGF-β在肺组织的定位，提出导致肺纤维化活动病灶内TGF-β1含量增加，初始是由于嗜酸性粒细胞﹑肺泡巨噬细胞表达增加，继之肌成纤维细胞、成纤维细胞表达增加所致。也有研究认为肺泡上皮Ⅱ型细胞是肺纤维化时TGF-β1阳性反应过度表达的重要来源。TGF-β在肺组织的定位和分布存在一定规律：损伤区巨噬细胞和嗜酸性粒细胞内TGF-β出现和升高较早；损伤区非炎症细胞（高度增生的Ⅱ型肺泡上皮细胞、细支气管和支气管粘膜上皮细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞）内TGF-β出现和升高的时间较晚［15］。在对TGF-β1基因的研究中，Awad等［16］发现TGF-β1基因中存在5个多态性位点，其中（+915）多态性的存在，使第25位密码子发生改变（脯氨酸代替了精氨酸），导致了个体间TGF-β1水平的差异。肺纤维化患者TGF-β1等位基因（精氨酸）出现的频率增加，导致TGF-β1生成增加，并最终促进了肺纤维化的发生。

　　2.2  TGF-β1对肺成纤维细胞的作用  肺脏是富含TGF-β的器官之一，肺纤维化直接与TGF-β的过度表达﹑ECM的过度沉积有关。TGF-β是成纤维细胞的化学吸引剂，它可刺激未成熟成纤维细胞生长，并促进组织的成纤维细胞聚集、扩散和分化。血小板是TGF-β的主要贮存部位，在损伤的组织部位，TGF-β促进血小板释放PDGF，通过PDGF促进肺成纤维细胞的增殖和纤维增生。在多种因素（博莱霉素、环磷酰胺和射线）导致的肺纤维化中均发现TGF-β1含量增高。TGF-β1以激活的形式过度表达导致持久的和严重的间质纤维化，这种纤维化以广泛的细胞外基质蛋白如胶原、纤维粘连蛋白和弹性蛋白的蓄积和肌成纤维细胞的出现为特征。TGF-β1不但能诱导其他因子的表达，更重要的是它可使成纤维细胞活化、增殖并转分化为肌成纤维细胞，促进纤维连接蛋白、糖蛋白和胶原等细胞外基质分泌，减少蛋白酶和趋化因子分泌，提高蛋白酶抑制物水平，促进整合素受体表达，最终导致肺纤维化。Ruocco发现，TGF-β1 在肺组织中具有刺激成纤维细胞增殖作用并可抑制肺泡Ⅱ型细胞成熟，阻断表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）对肺泡Ⅱ型细胞生长的刺激作用，同时它也促进ECM的合成，并可通过减弱肺泡巨噬细胞功能，使ECM免受蛋白水解酶溶解等途径起到抗炎作用［17］。TGF-β一方面能刺激成纤维细胞合成ECM，如胶原、纤维粘连蛋白、基质受体和糖蛋白；另一方面能抑制对新合成的基质蛋白产生的酶解作用。

　　2.3  TGF-β在调控ECM合成过程中的作用  急性肺损伤与修复中，TGF-β1 涉及到纤维增殖、修复的过程。它通过对ECM的调节来实现对肺损伤与修复的作用。TGF-β一方面上调基质成分基因的转录、翻译等步骤，如上调胶原和纤维粘连蛋白的基因表达，加强胶原和纤维粘连蛋白的合成，促进细胞外基质受体的转录、翻译和蛋白形成等，促进ECM的沉积；另一方面通过减少基质降解蛋白酶的合成和分泌，增加降解酶阻滞剂的合成和分泌抑制基质的降解。如它减少胶原酶和凝血酶原激活剂的合成；增加金属蛋白酶和凝血酶原的抑制剂合成。在肺间质中，胶原的主要类型是Ⅰ，Ⅲ，Ⅴ型。体外研究表明：TGF-β1不仅可刺激成纤维细胞，还可以刺激肺泡上皮细胞和肺动脉平滑肌细胞产生colⅠ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。 TGF-β mRNA水平增加和TGF-β蛋白的增多均可上调大多数基质蛋白mRNA水平，导致蛋白合成的增加；尤其可刺激肺成纤维细胞产生胶原纤维，诱导Ⅰ、Ⅳ胶原mRNA表达。研究表明博莱霉素诱导肺纤维化模型中TGF-β1 mRNA增加先于Ⅰ型胶原mRNA的增加［18］。Broekelmann发现IPF患者肺组织中TGF-β1蛋白和基因表达与胶原蛋白沉积相毗邻，在纤维化活动性病灶内含量更高［13］，说明TGF-β1对胶原蛋白持续沉积具有重要作用。TGF-β促进胶原基因转录的分子机制与Smad家族的信号转导有关。激活剂蛋白-1（activator protein-1，AP-1）是血小板凝血酶敏感蛋白，是TGF-β的主要激活物。AP-1被激活后，TGF-β与其细胞膜上的受体结合，将活化的信号转导传递至细胞内，细胞内的Smad家族（Smad 1、2、3、4、6等）将信号进一步传递到细胞核内，激活核内转录蛋白，即转录信号转导剂和激活剂（signal transducer and activator of transcription，STAT）-1，启动胶原蛋白mRNA的转录，合成胶原蛋白。

　　3  TGF-β1与细胞因子

　　肺巨噬细胞、肺泡Ⅱ型细胞、中性粒细胞、肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞可释放多种生物活性物质，如细胞因子、生长因子、炎症介质、趋化因子和蛋白酶等。研究表明，AM活化后释放的细胞因子（如IL-1、TNF-α、TGF-β、PDGF、IGF-1等）和炎症介质在早期肺损伤中起重要作用。这些细胞因子形成复杂的因子网络结构，引起肺泡炎和肺损伤。近来有学者指出,TGF-β不仅自身在肺炎发生和纤维化过程中具有重要作用,而且能诱导肺脏高水平表达结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）,加快肺纤维化的发生。TGF-β的生物学作用部分是由CTGF介导的［19］，CTGF是一种新近发现的促进成纤维细胞有丝分裂和胶原沉积的始动因子，TGF-β可通过诱导CTGF的合成，增加胶原蛋白的产生。TGF-β的表达依赖于TNF-α信号转导系统。在成纤维细胞族MLFs和Swiss 3T3中，ELISA实验证实，TNF-α处理的成纤维细胞导致明显的TGF-β蛋白表达增加，在此前PCR分析定量测得的TGF-βmRNA较正常状态增加2～4倍。Western印记分析表明TNF-α激活细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）。MRNA稳态实验表明TNF-α将TGF-β mRNA的半衰期增加到24h以上，而没有TNF-α刺激的细胞半衰期只有15h。表明TNF-α通过激活ERK特异性有丝分裂原激活蛋白激酶途径导致成纤维细胞TGF-β表达增加［20］。但TGF-β蛋白在缺乏TNF-α信号系统时仍能够有效表达，其机制有待进一步研究。

　　4  TGF-β及其受体未来研究方向的展望

　　TGF-β作为一种强烈的致纤维化因子,其在IPF发病中的作用已被肯定。修饰素即核心蛋白聚糖（decorin），是一种内生性的小分子的含亮氨酸较为丰富的蛋白多糖，与TGF-β有着高亲和力并对TGF-β生物活性具有抑制作用，是TGF-β的负向调节剂，具有潜在的抗纤维化作用。TGF-β受体在肺纤维化的发生发展中起着关键性作用，抗TGF-β抗体与可溶性TGF-β受体都能与TGF-β结合，阻碍TGF-β与其靶细胞表面的各型TGF-β受体结合而发挥其有效的抗纤维化作用。提示我们今后通过阻断TGF-β及其受体，可望在抗肺纤维化进程方面取得有意义的结果。

　　5  参考文献
 
　　［1］  Massague J.TGF-beta signal transduction［J］.Annu Rev Biochem，1998，67：753-791
 
　　［2］  万秋红.TGF-β超家族信号传导机制研究进展［J］.国外医学分子生物学分册，2000,22(3):137
 
　　［3］  Nunes I,Gleizes PE,Metz CN,et al.Latent transforming growth factor-beta binding protein domains involved in activation and trans-glutaminase-dependent cross-linking of latent transforming growth factor-beta［J］.J Cell Biol，1997，136(5):1151-1163
 
　　［4］  Akiyoshi S,Ishii M,Nemoto N,et al.Targets of transcriptional regulation by transforming growth factor-beta:expression profile analysis using oligonucleotide arrays［J］.Jpn J Cancer Res，2001，92(3):257-268
 
　　［5］  Blobe GC,Schiemann WP,Lodish HF.Role of transforming growth factor beta in human disease［J］.N Engl J of Med，2000，342(18):1350-1358
 
　　［6］  Verrecchia F,Mauriel A.Transforming growth factor-beta signaling  through the Smad pathway:role in extracellular matrix gene expression and regulation［J］.J Invest Dermatol，2002，118(2):211-215
 
　　［7］  Hironobu Ihn,MD,Ph D.Pathogenesis of fibrosis:role of TGF-β and CTGF［J］.Current Opinion in Rheumatology，2002，14:681- 685
 
　　［8］  Singer AJ,Clark RA.Cutaneous wound healing［J］.N Engl J Med，1999，341(10):738-746
 
　　［9］  Miyazono K.Positive and negative regulation of TGF-beta signaling［J］.J Cell Sci，2000，113(Pt 7):1101-1109

　　［10］  Shi Y,Hata A,Lo RS,et al.A structure basis for mutational  inactiration of the tumor suppressor Smad4［J］.Nature，1997，388(6637):87-93

　　［11］  Joseph S.Cell signality by receptor tyrosine kinase［J］.Cell，2000，103:211

　　［12］  Isaka Y,Tsujie M,Ando Y,et al.Transforming growth factor-beta antisense oligodeoxynucleotides block interstitial fibrosis in unilateral ureteral obstruction［J］.Kidney Int，2000，58 (5):1885-1892

　　［13］  Broekelmann T,Limper AH,Colby TV,et al.Transforming growth factor beta 1 is present at sites of extracellular matrix gene expression  in human pulmonary fibrosis［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1991，88(15):6642-6646

　　［14］  Khalil N,Bereznay O,Sporn M,et al.Macrophage production of transforming growth factor beta and collagen synthesis in chronic pulmonary inflammation［J］.J Exp Med，1989，170(3):727-737

　　［15］  Zhang K,Flanders KC,Phan SH.Cellular localization of transforming growth factor-beta expression in bleomycin-induced pulmonary fibrosis［J］.Am J Pathol，1995,147(2):352-361

　　［16］  Awad MR,El-Gamel A,Hasleton P,et al.Genotypic variation in the transforming growth factor-beta l gene: association with transforming growth factor-beta l production, fibrotic lung disease,and graft fibrosis after lung transplantatin［J］.Transplantation，1998，66(8):1014-1020

　　［17］  Yi ES,Salgado M,Williams S,et al.Keratin-ocyte growth factor decreases pulmonary edema,transforming growth factor-beta and platelet-derived growth factor-BB expression,and alveolar type Ⅱ cell loss in bleomycin-induced lung injury［J］.Information，1998，22(3):315-325

　　［18］  Breen E,Shull S,Burne S,et al.Bleomycin regulation of transforming growth factor-beta mRNA in rat lung fibroblasts［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，1992，6(2):146-152

　　［19］  Utsugi M，Dobashi K，Ishizuka T，et al.C-Jun-NH2-Terminal kinase mediates expression of Connective Tissue Growth Factor induced by Transforming Growth Factor-beta 1 in human lung fibroblasts［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2003，28:754-761

　　［20］  Sullivan DE,Ferris M,Pociask D,et al.Tumor necrosis factor-alpha induces transforming growth factor-beta expression in lung fibroblasts through the extracellular signal-regulated kinase pathway［J］.Am J Respir Cell MolBiol,2005,32(4):342-349

　　063000  河北省唐山市，华北煤炭医学院