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关键词 顺铂；肿瘤坏死因子；湿热效应；骨肉瘤
高温隔离灌注化疗作为骨肉瘤新辅助化疗的一部分，在控制肿瘤原发灶、提高保肢成功率等方面已取得了肯定的效果，但仍有40%左右的骨肉瘤患者在治疗后1年内复发或转移［1］。增强骨肉瘤的化疗效果，提高骨肉瘤患者的无瘤生存率是目前亟待解决的问题。
肿瘤坏死因子（TNF-α）是新近发现具有肿瘤热化疗增效作用的药物，已有在骨肉瘤治疗中应用的报道，但有关的实验研究甚少［2］。本研究拟观察TNF-α结合顺铂热化疗对人骨肉瘤细胞OS-732的作用，探讨其协同作用机制，为临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1．1 骨肉瘤细胞系 人类骨肉瘤细胞系OS-732 购自协和细胞库；传代培养条件为37℃，5%CO2和95%相对湿度；培养基为RPMI 1640，添加10%胎牛血清和100μg/ml青霉素和链霉素。
1．2 化疗药物 顺铂（DDP）购自齐鲁制药厂，人肿瘤坏死因子（TNF-α）为上海赛达生物药业有限公司产品。药物储存液根据说明书进行配制、储存于-20℃冰箱。
1．3 试剂和耗材 RPMI 1640 和胎牛血清为Hyclone 公司产品；MTT、二甲亚砜（DMSO）、碘丙碇（PI）、结晶紫和RNA酶均为Sigma公司产品；Caspase-3荧光生色底物DEVD-AMC购于Calbiochem公司，transwell小室和96孔培养板为Costar产品,matrigel和纤粘连蛋白分别为Becton Dichinson 和Promega公司产品。
1．4 温热效应研究 对数生长期OS-732细胞经胰酶消化后，计数后调整浓度，以每孔接种量为2.5×103/ml和2×104/ml，分别接种于96孔和24孔培养板中培养过夜，每个处理组3个平行孔。根据细胞株与不同药物的作用过程分成五组：①单纯温热处理1h。②在37℃和43℃用浓度为50μg/ml DDP作用1h。③在37℃用浓度为100U/ml的TNF-α作用24h。④先用浓度为100U/ml的TNF-α处理24h，然后用50μg/ml DDP于37℃和43℃分别处理1h。各组处理完后，小心吸出培养液，然后加入新鲜培养液200μl，继续培养24h，利用MTT比色法检测细胞活性，计算抑制率，流式细胞仪测定细胞周期。
1．5 MTT比色法 MTT的配制：以DPBS配制成5mg/ml,0.22μm滤膜过滤除菌分装,-20℃避光保存。96孔培养板每孔加入20μl的MTT使用液,继续培养4h后,小心吸去培养上清液,加入200μl DMSO溶解,振荡5min,每孔取100μl,以570nm的波长测定吸光度值(OD570),取3个平行孔均值。
1．6 细胞周期测定 OS-732细胞处理后，胰酶消化收集细胞，用冷PBS洗涤2次，再用-20℃预冷的70%乙醇固定48 h，1 000g离心10min弃去上清液，1 000μl PBS重悬加10mg/ml RNase 20μl，混匀，37℃水浴45min，PBS洗去RNase，100μl PBS重悬，加100μl PI 4℃避光染色30min。FACScan流式细胞仪测定，Cell Quest 分析软件进行细胞周期分析，确定细胞周期时相分布。
1．7 Caspase-3酶活性测定 细胞提取和Caspase-3活性测定的操作按Hopfner等［3］的方法进行。细胞提取物加入测定液中于37℃孵育1h，测定液组成：Caspase-3荧光生色底物DEVD-AMC 20μg/ml，HEPES 20mmol/L,glycerol 10%,DTT 2mmol/L,pH 7.5。Caspase-3切割DEVD-AMC后产生的荧光通过荧光仪进行测定,激发波长为360nm,发射波长460nm,结果与未处理对照组对比,计算活性比。
1．8 细胞侵袭分析 细胞侵袭重建基底膜实验在transwell小室中进行［4］。聚碳酸滤膜（8μm孔径）粘附于transwell 小室后，在滤膜的上下表面分别铺以10μg matrigel和5μg matrigel，用40μl培养基重建20min后备用。OS-732细胞经上述处理后，用0.025%EDTA/PBS消化,重悬于含0.1%BSA的RPMI 1640培养基中,约2.5×105细胞加入到transwell 小室中,37℃培养20h。侵袭至滤膜下表面的细胞用结晶紫染色后，随机选择5个400倍显微视野，统计视野中细胞数目，与37℃未处理对照组对比表示肿瘤细胞的侵袭能力。
1．9 统计学方法 采用SPSS 10.0统计分析软件,行方差分析q检验。
2 结果
2.1 TNF-α和温热化疗协同对OS-732细胞杀伤作用 MTT细胞活性测定表明,单纯热处理即能引起部分肿瘤细胞死亡;顺铂的杀伤作用随温度的升高而加强,TNF-α亦对OS-732细胞具有一定的杀伤作用。研究结果还表明,经TNF-α诱导24h后能够显著增强顺铂热化疗的作用,与顺铂热处理组比较差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。
图1 TNF-α、DDP和温热处理对OS-732细胞的抑制作用（略）
2．2 细胞周期研究 细胞周期研究表明，单纯温热处理能引起G0/1期细胞比例减少，而G2/M期细胞增加（P<0.05）。顺铂温热处理引起S期增加，G2/M期细胞减少（P<0.05）。与37℃对照组比较，TNF-α对OS-732细胞细胞周期无显著作用（P>0.05）。经TNF-α诱导24h后能够显著增强顺铂热化疗的作用，对处于各细胞周期的细胞均有杀伤作用，仅有少量G0/G1期存活，S期和G2/M期细胞几乎消失，并出现大量的坏死和凋亡。见表1。
表1 TNF-α、DDP和温热处理对OS-732细胞周期作用（略）
2．3 Caspase-3活性测定 经TNF-α诱导24h后能够显著增加顺铂热化疗对Caspase-3的诱导活化作用，其活性比为（145.5±5.5）%,而43℃处理组、TNF-α处理组、顺铂处理组、顺铂热化疗处理组分别为（105.2±1.5）%、(110.4±2.8)%、115.8±3.2)%、(125.2±3.6)%，TNF-α与顺铂热处理组与后4组比较差异有统计学意义（P<0.01），见图2。
图2 TNF-α、DDP和温热处理对Caspase-3酶活性的影响（略）
2．4 细胞侵袭能力研究 matrigel经重建后能在聚碳酸滤膜表面形成类似天然基底膜的结构，细胞侵袭穿过重建matrigel的能力反映该细胞的侵袭能力。本研究用TNF-α与顺铂热处理OS-732细胞后，细胞侵袭重建基底膜明显受到抑制，侵袭至滤膜下表面的细胞数降低到37℃对照组的（8.6±1.6）%,而43℃处理组、TNF-α处理组、顺铂处理组分别为（86.2±10.5）%、(84.4±13.8)%和(33.6±6.2)%，表明TNF-α与顺铂热处理可显著降低OS-732细胞的侵袭能力（P<0.05）,见图3、图4。
图3 TNF-α、DDP和温热处理对OS-732细胞侵袭能力的影响（略）
3 讨论
高温隔离灌注化疗控制骨肉瘤原发灶疗效显著，尤其在提高肢体骨肉瘤的保肢成功率方面具有肯定的作用。目前临床上认为高温隔离灌注化疗是骨肉瘤最佳的热化疗途径，在高温隔离灌注化疗中加入一些细胞因子（如干扰素、白介素和肿瘤坏死因子等）是将肿瘤的物理、化学和生物治疗相互结合以提高骨肉瘤局部控制作用的新型综合治疗手段。
图4 TNF-α、DDP和温热处理对OS-732细胞侵袭基底膜的影响（略）
TNF-α是近年来临床报道较多的一类生物调节因子。肿瘤坏死因子全身使用效果并不理想（毒副作用明显，甚至会引起败血症性休克），局部用药减少了全身及肢体的毒副作用，不仅有直接抗肿瘤细胞作用，而且局部较高浓度的肿瘤坏死因子接触肿瘤血管壁，能在肿瘤组织的血管中形成血栓从而破坏肿瘤组织营养供应［5，6］。目前，有关TNF-α与热化疗结合对骨肉瘤细胞的作用及其机制的研究报道不多。
我们进行体外OS-732细胞系作用模型研究， 发现TNF-α预处理能增加骨肉瘤细胞对药物的敏感性，从而显著提高顺铂热化疗的细胞杀伤效果。细胞周期研究表明，43℃顺铂与37℃及43℃温热组比较细胞周期有明显的改变，细胞株的S期比例明显增加，G2/M期比例明显减少，G0/G1期比例无明显改变，说明顺铂热化疗能阻滞骨肉瘤细胞由S期向G2/M期移行，使细胞不能进行足够的分裂和修复而加速死亡，另外处于S期的骨肉瘤细胞对热疗敏感，易被杀伤。本研究还显示，TNF-α对OS-732细胞的作用没有细胞周期特异性，与vander Veen等［7］报道一致，表明其对顺铂热化疗的协同作用并非细胞周期依赖性。
肿瘤化疗的目标就是杀伤肿瘤细胞，诱导其凋亡。Caspase-3酶为凋亡路径的效应蛋白，Caspase-3酶活化能够引发下游中晚期凋亡事件。本研究表明，热疗和顺铂单用或联用均有诱导OS-732细胞Caspase-3酶活化的能力，因此热疗诱导骨肉瘤细胞凋亡可能是热疗提高骨肉瘤顺铂化疗敏感性的潜在机制之一［8］。其次，热疗使细胞膜的通透性增加，顺铂进行细胞增多，与DNA链内或链间形成铂架桥速度加快也是其机制之一。此外，TNF-受体超家族（TNFR）能够介导凋亡路径的信号传导，从而活化路径下游的效应酶（Caspase-3、Caspase-9等），诱导细胞凋亡［9］。Caspase-3活性分析结果表明，经TNF-α预处理的细胞较易被顺铂热化疗处理诱导凋亡。因此TNF-α与顺铂热化疗的协同作用主要是通过活化Caspase-3酶，强化细胞凋亡而得以实现，同时，该协同作用能显著降低骨肉瘤细胞侵袭能力。
综上所述，TNF-α结合顺铂热化疗具有良好的协同作用，能够加强顺铂热化疗对骨肉瘤细胞的杀伤效果，强化其凋亡，降低骨肉瘤侵袭转移风险，具有实际临床应用前景。
4 参考文献
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