结缔组织生长因子的研究进展

　　关键词  结缔组织生长因子；转化生长因子；纤维化；细胞外基质

　　结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)是1991年Bradham等［1］ 在应用血小板源性生长因子(platete rivied growth factor，PDGF)抗体筛选人类脐静脉内皮细胞cDNA(互补脱氧核糖核酸)文库时首次发现。它广泛表达于人类多种组织器官中，在病理情况下，其过度表达与某些增生性或纤维化疾病的发生发展密切相关，如硬皮病、肾纤维化、肝硬化、肺纤维化、动脉粥样硬化等。现就CTGF的研究进展作一综述。

　　1  CTGF的结构和生物学功能

　　1.1 CTGF基因及其蛋白质结构                                    
　　CTGF是一种新发现的可刺激成纤维细胞增殖和胶原沉积的生长因子，是高度保守的CCN（CTGF、Cef10/cyr61和Nov的缩写）多肽家族中的成员。该家族目前包括鸡胚成纤维细胞经诱导产生的Cyr61、3T3细胞受血清刺激后产生的Fisp-12、成年鸡肾细胞中表达的Nov、非洲爪蟾成纤维细胞产生的Xnov和人类CTGF。它们均属于即刻早期基因（immediate early gene），产物的功能大多是激活或抑制调节细胞增殖分化及迁移运动，共同结构特点是具有很高的序列同源性和序列结构的类似性。

　　CTGF蛋白为肝素结合型，含349个氨基酸，富含半胱氨酸，其分子量约为36~38kD，可由成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞合成分泌。成年哺乳动物心、脑、肾、肺、肝胎盘中均有表达。人类CTGF基因定位于染色体6q23.1，包括5个外显子，4个内含子。起始位点为ATG，其3′端包含三个ATTTA位点。CTGF蛋白的38个保守的半胱氨酸残基分成两个节段，其中22个在N末端区，16个在C末端区，4个主要的蛋白结构区为胰岛素样生长因子的结合蛋白区、von Wille-brand因子C型重复、血小板反应蛋白（throm bospondin）I型重复以及生长因子半胱氨酸群，这些区域都由独立的外显因子编码。Segarini等［2］发现将CTGF连接主细胞表面的蛋白质的分子量大约620kp,是一种多配基受体,即低密度受体相关蛋白/a2巨球蛋白的受体,后者在介导CTGF的生物活性方面发挥重要作用。

　　1.2 CTGF的生物学功能

　　1.2.1  促进细胞增殖，合成胶原                                    
　　CTGF和转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGFβ)均可显著增加正常大鼠肾(normal rat kidney，NRK)成纤维细胞中Ⅰ型胶原、整合素α5和纤连蛋白基因的转录而引起肾脏纤维化的发生与进展。CTGF不能诱导NRK成纤维细胞悬浮生长，却是TGFβ刺激NRK成纤维细胞增殖和生长过程中必须的介质。抗CTGF的抗体和反义CTGF可分别从蛋白水平和核酸水平特异性的阻断TGFβ对NRK成纤维细胞的诱导作用。利用原位杂交技术在系统性硬化症患者硬化损害区的成纤维细胞细胞中检测到CTGFmRNA表达，硬化期成纤维细胞中CTGF mRNA表达较炎症期明显增高，成纤维细胞过度表达CTGF可促进细胞的迁徙，增殖及产生基质促进纤维化的进程，提示CTGF与纤维化密切相关。Ⅱ型肺泡上皮细胞及激活的成纤维细胞通过自分泌或旁分泌方式产生CTGF，调节成纤维细胞的和细胞外基质的积聚，在肺纤维化进展中起重要作用。高糖和高胰岛素是通过上调非酒精性脂肪肝中CTGFmRNA的表达而引起纤维化的进展。胆管上皮细胞合成和分泌一些旁分泌介质如：TGFβ、CTGF、PDGFB及内皮素1作用于不同的肝细胞，导致门静脉性肝硬化。以上资料表明CTGF在不同器官的纤维化进程中起重要作用。

　　1.2.2 调节细胞外基质基因的表达                                    
　　CTGF能够刺激成纤维细胞增殖、细胞外基质产生、肉芽组织形成和纤维化。Twigg SM等［3］发现在人成纤维细胞中，重组CTGF诱导纤维连接蛋白mRNA的表达和蛋白质的合成，并呈剂量依赖性关系。CTGF中和性抗体可以显著降低但不能完全抑制这种作用。Shi-wen等［4］通过对体外培养的人皮肤成纤维细胞的研究发现转染CTGF反义基因或用中和性抗体都能抑制TGFβ1诱导的细胞外基质如胶原等的合成。而转染CTGF重组体使之表达或直接应用、重组CTGF刺激都能诱导细胞外基质合成，这表明CTGF能够直接诱导结缔组织细胞增殖和细胞外基质合成。在多种细胞中，CTGF蛋白作用或CTGF基因转染都能刺激纤维连接蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、整合素等细胞外基质成分合成。用抗CTGF中和抗体或CTGF反义核酸来阻滞CTGF的作用，能抑制某些药物或TGFβ所诱导的细胞外基质成分产生。动物实验表明，在诸多纤维化疾病模型都有CTGF的高表达。在人体多种器官纤维化疾病、创口愈合等过程，都伴随有CTGF表达的增高，提示CTGF广泛地参与了生成细胞外基质的生理或病理过程。

　　1.2.3 介导细胞粘附                                   
 
　　CTGF促进细胞粘附、增殖和存活功能是通过内皮细胞的α5β3整合素、血小板的α2bβ3整合素、αbβ1整合素及成纤维细胞表面的乙酰肝素硫酸酯蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans，HSPGs)介导完成的［5］。与成纤维细胞粘附至纤维结合素、层粘连蛋白和Ⅰ型胶原相比，CTGF介导粘附作用范围更加广泛：形成线状和扁平伪足的时间更长；可以激活细胞内信号转导分子如粘连激酶；至少可以维持P42/P44MAPKs(mitogen activated protein kinase，丝裂原激活的蛋白激酶)的激活状态达9h；延长基因表达的时间。

　　1.2.4 刺激细胞迁移                                    

　　Fan等［6］发现，在体外实验中，如果CTGF表达过度，血管平滑肌细胞的生长率和迁移率都将有显著增加，而且该作用可被CTGF中和性抗体逆转。Shimo等［7］发现，在培养皿中只有那些处于增殖期和正在迁移至空白区域的细胞CTGF表达呈阳性，应用CTGF反义寡核苷酸和反义RNA则可以阻滞这些细胞的增殖和迁移。CTGF这种趋化细胞的作用可以促进它的促新生血管形成活性，并且可能在创伤愈合过程中趋化成纤维细胞至伤处起重要作用。

　　1.2.5  促进血管形成                                    

　　损伤修复和纤维化疾病常同时出现细胞外基质沉积和血管形成。重组CTGF（rCTGF）可剂量依赖地促进血管内皮细胞的粘附、增殖和迁移，同时诱导血管内皮细胞形成管状，比碱性成纤维细胞生长因子或血管内皮生长因子作用强。将rCTGF应用于鸡的尿囊绒膜可导致完全的血管形成作用，该作用可被抗CTGF抗体抑制。CTGF在体内和体外均有促血管生成作用。

　　1.2.6 促进软骨增生和骨骼发育                                    
　　Nakanishi等［8］发现CTGF基因在兔的软骨细胞和人的软骨肉瘤细胞中均有强阳性表达，而成骨细胞中则无表达。原位杂交结果显示CTGF主要表达于胎鼠的肋软骨细胞和脊柱的肥大软骨细胞中。Xu等［9］发现大鼠骨硬化病模型和正常大鼠的骨骼之间存在CTGF表达的显著差异。此外，前列腺素E2可以上调CTGF基因的表达，而前者已知可以调节成骨细胞的分化，在骨骼发育过程中起重要作用。因此，CTGF在软骨的发生和骨骼的发育、塑形以及重塑过程中发挥重要作用。

　　1.2.7 诱导细胞凋亡                                    

　　人CTGF显著降低主动脉血管平滑肌细胞活性，增强caspase-3活性，促进细胞凋亡。在人乳腺癌细胞MCF-T中CTGF作为前凋亡因子，部分下调bcl-2蛋白，介导TGFβ诱导的凋亡。

　　2 CTGF表达的调控

　　2.1 转录水平的调控                                    

　　机体损伤和纤维化发生时，CTGF高表达并作为TGFβ的下游介质介导细胞外基质的生成。TGFβ对CTGF的产生具有明显的选择性，在CTGF基因启动子序列中存在TGFβ的顺式调控元件（TGFβRE），位于启动序列-162bp和-128bp，该元件的点突变将导致TGFβ完全丧失诱导活性，PDGF、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,FGF）对CTGF的诱导作用相对较弱。CTGF仅在人皮肤成纤维细胞、胎牛主动脉平滑肌细胞NIH/3T3成纤维细胞表达，上皮细胞或淋巴细胞中未见表达［10］。TGFβ通过依赖SMAD2、3和4介导基因表达，SMAD6和7表现出拮抗SMAD受体相互作用的特性。SMAD2和3即刻与Ⅰ型TGFβ受体激酶相互作用，在它们的羧基端磷酸化，然后SMAD2或SMAD3与SMAD4形成复合物，转移至核内，激活靶基因的表达。DNA基序GTCTAGAC可提供SMAD3·SMAD4复合物的结合位点。将SMAD3和4转染成纤维细胞，可促进CTGF启动子活性，而SMAD7抑制TGFβ诱导的CTGF表达。原癌蛋白ski和snoN与SMADs结合可阻断依赖SMAD的基因表达，降低TGFβ对CTGF的诱导作用。在硬皮病成纤维细胞中CTGF启动子活性升高，不依赖于SMAD结合位点，该位点突变并不影响CTGF的启动活性。而先前在CTGF启动子上发现的TGFβRE对于正常成纤维细胞中CTGF基础启动活性是必须的，对硬皮病成纤维细胞中CTGF启动活性的升高也是必须的。AP-1，CREB与Sp1，这些参与其它TGFβ应答反应的因子，均不与TGFβRE结合，维持真皮硬化表型不依赖SMAD介导的TGFβ信号通路系统，而是依赖CTGF水平的升高。

　　CTGF启动子-244bp和-166bp之间的序列是TGFβ和TNFα调控CTGF表达所共同必需的区域，位于调控元件TGFβRE的上游。TNFα可促进ⅠκB磷酸化，使核转录因子kappaB（NF-kappaB，NF-κB）活化并进入细胞核，激活基因的转录，提示NF-κB可能参与了抑制CTGF的表达。TNFα也可能通过升高SMAD7水平的方式发挥抑制作用。尽管TNFα能够抑制TGFβ诱导正常的和硬皮病患者皮肤成纤维细胞中CTGF和胶原合成，但不能抑制硬皮病患者成纤维细胞中CTGF的基础表达。推测CTGF高水平表达以及它对副调控细胞因子TNFα的无响应性可能是导致皮肤过度瘢痕形成和内部器官纤维化的关键因素之一。

　　2.2  稳定化CTGF mRNA                                    

　　激肽β1受体激动剂去-10精氨酸-胰激肽可刺激人胚胎肺成纤维细胞中β1受体上调引起胞浆Ca2+升高，稳定化 CTGFmRNA并能与β1受体交联，增加COL-α1(Ⅰ)mRNA，以剂量和时间依赖方式刺激Ⅰ型胶原的产生，在β2受体激活的成纤维细胞中未见以上现象。β1受体的拮抗剂去-10精氨酸-9亮氨酸-胰激肽可阻断β1受体对CTGFmRNA的上调作用。CTGF3′非转录区（996核苷酸）包含三个AUUUA五聚物，每个AUUUA五聚物组成九聚物核心，与UUAUUU（U/A）具高度同源性，可使mRNA去稳定。去稳定蛋白与CTGF的AUUUA元件结合，招募RNase和其他的胞浆蛋白，使 CTGFmRNA不稳定，去-10精氨酸-9亮氨酸-胰激肽，通过去稳定蛋白的前转录修饰，降低去稳定蛋白与RNA蛋白的结合亲和力或通过增加空间位阻阻断去稳定蛋白与其他胞浆蛋白形成复合物，使 CTGFmRNA稳定。

　　2.3 调控CTGF的信号通路                                    
　　在生物体内几乎全部类型的成纤维细胞的研究中，能诱导CTGF表达的主要因子就是TGFβ1。CTGF主要通过SMAD介导的TGFβ1通路，还有一部分是通过活化的磷脂酶C、PKC和GGTasa通路来实现的。Grotendorst等［11］亦发现升高靶细胞中cAMP水平能选择性抑制CTGF基因表达和胶原合成。蛋白激酶C的活化对CTGFmRNA的表达有抑制作用，当抑制PKC和酪氨酸激酶活性后则刺激CTGF的表达。PGE2可能也通过增强cAMP活性。激活PKA或PKA活化的激酶，使转录共激活因子CPB/P300磷酸化，阻断其与AP1的相互作用，从而抑制CTGF转录。

　　3  影响CTGF表达的因素

　　3.1 TGFβ1                                    

　　Igarashi等［12］发现在体外TGFβ1可以诱导人包皮的成纤维细胞产生高水平的CTGF及细胞外基质成分，而其他生长因子如PDGF、表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子等则没有这种作用。环己亚胺不能阻断这种刺激作用，这表明CTGF基因的表达是由TGFβ1直接调控。在组织创伤修复时，再生组织中TGFβ1表达的增高发生在CTGF增高之前，这表明体内存在着控制组织再生和修复的级联反应。持续纤维化组织的形成需要几种生长因子的共同作用，其中TGFβ1诱导纤维化，而CTGF则维持纤维化的发展［13］。此外，应用CTGF反义寡核苷酸或中和性抗体则能抑制TGFβ1诱导皮肤纤维化的作用，表明TGFβ1是通过CTGF的介导才能发挥其促纤维化作用。

　　3.2 糖皮质激素                                    

　　在临床上糖皮质激素（glucocorticoid）常常被用来治疗纤维化疾病。Dammeier等［14］发现在体外培养的成纤维细胞中，应用地塞米松干预后可以观察到CTGF的表达显著增高，并呈时间和剂量依赖关系。很明显这种现象没有TGFβ1的介入，因为糖皮质激素对TGFβ1的作用是下调其表达。此外，在系统性应用糖皮质激素治疗小鼠的许多组织和器官CTGF的表达水平都有所增加。当皮肤被损伤后，未经糖皮质激素治疗的小鼠伤处可见CTGF的强烈表达。然而应用糖皮质激素治疗后，和未损伤处皮肤相比，损伤处皮肤的CTGF mRNA的表达没有更进一步的增加。以上表明糖皮质激素可刺激正常组织和器官中CTGF的表达，但在严重炎症区域则不能。

　　3.3 纤维蛋白酶                                    

　　纤维蛋白酶（thrombin）在止血、炎症前期和纤维化前期等阶段发挥着重要作用。Chambers等［15］发现生理浓度的纤维蛋白酶 使胎儿成纤维细胞的CTGF mRNA的表达上调5倍，可以使成人体外原代培养的成纤维细胞CTGFmRNA的表达上调7倍，同时伴有CTGF蛋白合成的增加。环己亚胺和TGFβ1中和性抗体都不能影响这种效应。表明在正常组织修复和纤维化的过程中，纤维蛋白酶能够有效的诱导CTGF的表达，进而促进结缔组织的形成。

　　3.4 机械应激                                    

　　机械应激（mechanical stress）在创伤愈合、纤维化和瘢痕增生等情况下，成纤维细胞极易受机械力改变的影响。Schild等［16］发现机械应激后，在众多基因中CTGF的表达上调程度最显著，而且是可逆的。在机械应激消除后不到6h，CTGF mRNA的表达达到一个新的稳态水平。机械应激能够直接刺激CTGF的高水平表达，因为在机械应激后产生的TGFβ1的量不足以刺激CTGF高水平表达。Kessler等［17］发现处于机械应激状态下的成纤维细胞表现出合成型的细胞表型，同时伴随着CTGF的增加 和细胞外基质降解的减少，从而间接证明了机械应激可以诱导高水平的CTGF表达。

　　3.5 肿瘤坏死因子                                    

　　最近的研究表明肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）对促进炎症的发生和诱导基质金属蛋白酶基因的表达是十分必要的，并在创伤愈合的早期阶段发挥着重要作用。Abraham等［18］发现在体外培养的成纤维细胞中TNF能够抑制TGFβ1诱导CTGF蛋白表达。这种作用能够被NF-κB的抑制剂阻断，表明TNF可能通过NF-κB的信号通路发挥作用。

　　4  展望

　　结缔组织纤维化几乎成了各种组织器官损伤后共同的终末病理过程，细胞因子所起的作用已越来越为人们所重视。CTGF的发现为控制纤维化提供了一个新的治疗靶，针对CTGF的治疗可能会比针对TGFβ的治疗更有实用意义，根据目前的初步研究拮抗CTGF似乎可以更专一地拮抗细胞增殖肥大和ECM进行性积聚，而不影响TGFβ的抗炎症等有益机体的作用。通过对CTGF基因表达调节，信号转导途径和受体结合途径的进一步研究，选择治疗策略阻断CTGF的基因表达，应用CTGF 中和抗体或受体拮抗剂来阻断 CTGF信号传导表达和生物学活性，这可能是控制纤维化疾病发生和发展的一种崭新手段，为今后防治纤维化疾病带来新的希望。

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　　河北省唐山市，华北煤炭医学院