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关键词 卡那霉素；阿米卡星；分支杆菌，结核；突变；
反向斑点杂交；耐药性
过去通常认为，氨基甙类卡那霉素（KM）和阿米卡星（AMK）在结核分支杆菌是完全交叉耐药的。
自从1944年链霉素（SM）在治疗结核方面取得显著成效以来，氨基甙类药物已成为肺结核治疗的主要用药。KM和AMK一般被用于耐多药肺结核（MDR-TB）的治疗。SM的结核分支杆菌耐药情况比较复杂，跟核糖蛋白S12（rpsl基因）及其相关的16SrRNA基因（rrs）等点突变相关常在516和915位点附近。对于大肠埃希菌而言，KM耐药突变位点常出现在rrs基因的1400区域。
大量的研究表明，SM与KM和AMK不存在交叉耐药现象，而AMK和KM之间的交叉耐药现象已被反复报道。
经调查河南省肺结核患者一线药的初始耐药为11%，作为SM代药物的KM和AMK被用于MDR-TB的治疗，尽管存在着交叉耐药现象，我们发现96例耐KM的临床耐多药结核分支杆菌株中有47例对AMK是敏感的。
1 材料与方法
1．1 菌株来源与药敏测定
①本研究所用96例结核分支杆菌临床株及10例参照株分别来自河南省胸科医药医院、河南省疾病预防控制中心。②MIC药敏测定法：7H10培养基，2，4，8，16，32，64，128，256μg/ml AMK，MIC>4μg/ml为耐药。
1．2 引物和探针的设计与合成
根据野生型结核分支杆菌H37Rv的rrs基因序列（BX842576），针对rrs基因高突变区中最常见的突变位点，我们设计了二条（516、1400位点）野生型寡核苷酸探针，同时设计上、下游引物R1和R2，序列分别为R1（GGCTCCCTTTTCCAAAGGGAG）和R2（GGGGCGTTTTGCTGGTGCTCC），其中R2的5′端应用生物素标记，扩增片段为1 589bp。引物与探针由上海博亚生物技术有限公司合成，应用浓度为25pmol/μl。
1．3 基因组DNA提取
采用华舜生物工程有限公司的细菌基因组DNA抽提试剂盒，并加以改良。首先是刮取菌落，用1mlTE（Tris-EDTA,pH 5.0）稀释，离心后收集菌体，加入200μl裂解液，彻底振荡悬浮，37℃温育30min以上，以裂解结核分支杆菌细胞壁。随后参照试剂盒说明进行操作，取2μl上清液作为模板。
1．4 rrs基因片段的扩增
PCR扩增采用50μl反应体系，引物R1和R2各0.25pmol/L,200nmol/L dNTP,2.5Taq Plus DNA 聚合酶，模板DNA1-2μl。反应条件为94℃预变性3min,94℃1min→60℃1min→72℃45s,30个循环后，72℃延伸5min。PCR产物克隆至pBluescriPt ⅡSK(+)载体中，以制备模板。
1．5 反向斑点杂交
取探针25pmol依次点在尼龙膜条上，并将带有生物素标记的下游引物R2点膜0.5μl作为阳性对照，通过紫外交联仪进行紫外交联。将膜条于37℃杂交液中预杂交30min，取加热变性的PCR产物30μl 加入杂交液中，55℃振荡杂交1h以洗液A（2×SSC，0.1%SDS）和洗液B（1×SSC，0.05%SDS）分别于55℃和室温下洗膜10min。应用酶结合液室温作用其所长20min，以酶洗涤液A和B各洗膜5～10min。最后应用NBT/BCIP室温显色，蒸馏水洗膜后判定结果。
2 结果
MIC检测显示，96例耐KM耐药株中有47例（MIC值8～32μg/ml）对AMK（MIC值≤1μg/ml）敏感。
我们以上述47例菌株为对象，同样设置了5例双耐株（其MIC值>256μg/ml），5株双敏株（其AMK的MIC值≤1μg/ml、KM的MIC值1～4μg/ml）作为参照，同时进行SM耐药检测（≥4.0μg/ml为耐药）。利用反向斑点杂交法进行突变位点检测。结果所有的5株KM和AMK的高浓度耐药株在16S rRNA1400位点都发生了A→G的突变,而46例KM的MIC值≤64μg/ml菌株及5株双敏株在该位点未见突变。47例临床株中，我们检测到另外2例16S rRNA516位点发生了C→T （KM的MIC值为32～64μg/ml）的突变且均为SM敏感，其余在rrs基因中示见突变。
3 讨论
反向斑点杂交法的基本原理是应用生物素标记的特异性引物扩增目的DNA，使PCR产物上带有生物素标记物，将PCR产物变性后与固定在膜上的寡核普酸探针进行杂交，然后通过酶免疫显色法获取结果。已有众多学者应用该方法进行分支杆菌及其他病原体的检测和种属鉴定，均取得了较为敏感的检测结果［1］。同样，应用该方法检测序列变异时，若靶序列内存在突变，则其扩增产物在严格的条件下无法与探针杂交，无杂交信号就表示目的基因存在突变［2，3］。正向杂交须先将PCR产物固定，再与检测探针进行杂交，这样就要对每个标本的扩增产物进行固定，增加了操作步骤。而我们采用的反向杂交则预先将检测探针固定在尼龙膜上，再与变性的带有生物素标记的PCR扩增产物进行杂交，进而通过酶联反应显色。探针的固定在检测操作前就可准备好，只需对PCR产物交性后即可进行杂交，从而使操作明显简便、省时，适于大样本的检测，容易被一般的实验室接受。
有报道认为516位点突变不仅与KM耐药相关，而且在SM耐药株中有同样的突变，因此有人建议将其作为SM耐药标记位点。而我们的结果与之有矛盾，2例516突变株均是SM敏感。
通过本研究， 在47例对KM耐药而对AMK敏感的耐多药结核分杆菌菌株中，我们没有发现1400位点突变，而高浓度AMK-KM耐药株则均发生了突变。提示rrs基因的1400位点可以作为高浓度AMK-KM耐药的一个重要标记。而AMK-KM耐药的不一致可能与rrs基因的1400位点尚未突变有关。
同时，我们的资料也显示，AMK和KM虽存在一定程度的交叉耐药，作为临床结核分离株，还应该同时作二种药物的药物敏感实验。
参考文献
［1］Fiss EH,Chehab FF,Brooks GF.DNA amplification and reverse dot-blot hybridization for detection and identiflcation of mycobacteria to the specics level in the clinical laboratory［J］.J Clin Microbiol,1992,30(5):1220-1224
［2］De Beenhouwer H,Lhiang Z,Jannes G,et al.Rapid Detection of rifampicin resistance in sputum and bilpsy specimens from tuberculosis patients by PCR and line probe assay［J］.Tuber Lung Dis,1995,76(5):425-430
［3］Matsiota-Bernard P,Vrioni G,Marinis E.Characterization of rpoB mutations in rifampin-resistant clinical mycobacterium tuberculosis isolates trom［J］.Greece J Clin Microbiol,1998,36(1):20-23
河南省郑州市,河南省胸科医院内六科
河南省罗山县县医院
河南省太康县卫生防疫站