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关键词 神经节苷脂；基底神经节；神经元；神经保护作用；体外培养
谷氨酸可通过兴奋性毒性和氧化性毒性二种途径对培养的神经元产生毒性作用。高浓度谷氨酸通过激活谷氨酸受体引起一系列病理变化，最终导致神经元肿胀、代谢紊乱而死亡。神经节苷脂（monosialoganglioside，GM1）能促进中枢神经元损伤后的恢复，并能抑制神经元的凋亡。本实验旨在通过原代培养的胎鼠脊髓神经元，研究GM1是否会有效地防止由兴奋性谷氨酸造成的损伤，为临床上治疗神经元的损伤提供可靠依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
滨州医学院实验动物中心提供的胎龄为15d的Wister胎鼠。
1.1.2 主要试剂与仪器
GM1、多聚赖氨酸（美国Sigma公司）、IX-70 倒置相差生物显微镜（日本Olympus）、CLSM510激光扫描共聚焦显微镜（德国ZEISS公司）、PCR仪（Tpersonal Biometra biomedizinische）。
1.2 脊髓神经元细胞培养
无菌条件下取胎龄为15d胎鼠，用D-Hank’s液冲洗3次，取脊髓，加入5～10倍体积的0.25％胰蛋白酶溶液（pH 7.4～7.8），37℃孵育消化10min，用培养液调整细胞浓度为3×105/ml 细胞悬液。接种于24孔板中，每孔放入，加入1ml细胞悬液，置37℃ 5％CO2培养箱中培养。
1.3 实验分组
将以上原代培养的胎鼠脊髓神经元随机分为三组。①正常对照组：原代培养的脊髓神经元培养48h，然后加入50μl无菌去离子双蒸水孵育12h；②谷氨酸损伤组：对原代培养的脊髓神经元培养48h，然后加入谷氨酸（终浓度2mmol/L）孵育12h；③GM1保护组：将原代培养的脊髓神经元培养48h，然后同时加入谷氨酸（终浓度2mmol/L）和GM1（终浓度10ng/ml）孵育12h。
1.4 倒置相差显微镜观察各组神经元形态变化
用倒置相差显微镜观察各组原代培养的脊髓神经元和脊髓神经元在12h和24h时的形态学特征，培养至48h，根据实验分组分别给予不同的干预因素处理12h，观察并拍照后进行以下一系列处理。
1.5 MTT鉴定法
MTT法鉴定脊髓神经元的生存状态。
1.6 GAP43和NF-L的mRNA表达检测
1.6.1 引物设计
GAP43引物以GeneBank上登录的mRNA序列为模板，使用Primer Premier 5.0进行跨内含子引物设计。对所设计的引物Blast进行同源性分析，以排除可能的非特异产物的出现。内参照引物是Rat β-actin引物。引物序列如下：GAP43上游引物：5′-GGGAGATGGCTCTGCTACT-3′；GAP43下游引物：5′-AGACAGGGTTCAGGTGGG-3′；预计扩增GAP43片段长度为778bp。NF-L引物以GeneBank上登录的mRNA序列为模板，使用Primer Premier 5.0进行跨内含子引物设计。对所设计的引物Blast进行同源性进行分析，以排除可能的非特异产物的出现。内参照引物是由β-actin引物。引物序列如下：NF-L上游引物：5′-GAAGAAGGTGGTGAGGGTG-3′；NF-L下游引物：5′-AACTGGTTGGTTTGGTGATG-3′；预计扩增NF-L片段长度为356bp。β-actin上游引物：5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAAC-3′；β-actin下游引物：5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′；预计扩增β-actin片段长度为317bp。
1.6.2聚合酶链反应
在20μl RT产物的0.5ml Eppendorf管中继续加入表1所示试剂，快速混匀，95℃ 5min，冰浴冷却，然后快速离心。加入2μl(1U/μl) Taq DNA聚合酶，快速混匀，加入60μl液体石蜡。循环条件：94℃ 1min；58℃ 1min；72℃ 1min；共35个循环，最后72℃延长7min。表1 聚合酶链反应(略)
1.6.3 PCR产物的琼脂糖电泳分析
PCR反应结束后，用0.5×TBE电泳缓冲液配制1.8%的琼脂糖凝胶，分别取目的基因与内参照基因PCR扩增产物5μl加入，加入1μl 6×上样缓冲液，混匀，点入相邻的点样孔。接通电源，电压为90V，DNA向正极涌动。采用1kb Marker（共14条带：250bp,500bp,750bp,1 000bp,1 500bp,2 000bp,2 500bp,3 000bp,3 500bp,4 000bp,5 000bp,6 000bp,8 000bp,10 000bp）作为分子量标准，将产物同预计的大小进行比较。电泳结束后，加入EB染色，应用凝胶成像系统成像，用捷达801凝胶成相分析系统3.3进行表达强度分析。以待测基因与相应内参照光密度比值计算相对系数。
1.7 统计学方法
实验数据以±s表示。用SPSS统计软件进行统计学分析，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 各组脊髓神经元倒置相差显微镜动态观察结果
刚接种的胎鼠脊髓神经元均匀悬浮于培养液中。静置培养12h后，绝大多数细胞已经贴壁，分散均匀，多数细胞开始长出单个或多个突起。培养24h后，神经元胞体立体感增强，有明显的折光性，光晕明显，多数细胞呈簇状聚集，细胞突起相互交织成网状，也有单个神经元分散于细胞簇之间，并发出1个或多个突起加入邻近的神经纤维网。48h后，神经元突起形成密集的神经纤维网，胞体饱满，折光度好（图1）。谷氨酸作用12h后，大部分细胞立体感和折光度下降，突起断裂、变短，有的神经元胞体肿胀，有的神经元胞体则出现皱缩甚至裂解而只能观察到其细胞核，有的细胞则有脱壁现象（图2）。GM1保护组细胞生长状态则明显好于损伤组，单从活细胞观察，在形态学上与正常对照组的细胞并无明显异常（图3）。
2.2 各组脊髓神经元存活率检测结果
MTT法检测神经元存活率表明，谷氨酸对神经元的氧化性损伤使部分脊髓神经元细胞死亡或存活率降低，与损伤组相比，GM1保护组可维持较高的细胞存活率（表2）。表2 各组脊髓神经元存活率检测结果（略）注：三组比较P<0.05
2.3 脊髓神经元GAP43基因表达
正常组GAP43的mRNA表达量最大，损伤组的表达量明显少于正常组，而保护组高于损伤组（图4）。
定量分析结果为正常组（31.277±4.127），损伤组（2.547±1.062），GM1保护组（7.047±1.704）。各组比较差异有统计学意义（P<0.01）（图5）。
2.4 脊髓神经元NF-L mRNA基因表达
脊髓神经元正常组NF-L mRNA表达量最大，损伤组的表达量明显少于正常组，而保护组高于损伤组（图6）。
定量分析结果为正常组（110.763±13.678），损伤组（4.966±2.601），GM1保护组（31.731±6.082）。各组比较差异有统计学意义（P<0.01）（图7）。
3 讨论
3.1 GM1对谷氨酸损伤体外培养脊髓神经元的影响
谷氨酸可通过兴奋性毒性和氧化性毒性二种途径对培养的神经元产生毒性作用。高浓度谷氨酸通过激活谷氨酸受体引起一系列病理变化，最终导致神经元肿胀、代谢紊乱而死亡。氧化性毒性是谷氨酸通过竞争谷氨酸/胱氨酸逆转运子从而破坏细胞对胱氨酸的稳定摄取状态，引起细胞内GSH含量下降，活性氧成分堆积，最终导致细胞死亡。低浓度谷氨酸（2mmol/L）造成的神经元损伤可通过特异的谷氨酸受体拮抗剂来加以抑制；原代培养的皮层神经元不含活跃的谷氨酸受体，因此谷氨酸造成的神经细胞损伤是通过氧化性途径而非兴奋性途径［1］。对于兴奋性氨基酸的损伤，神经元在低剂量的兴奋性氨基酸作用下主要以凋亡方式死亡，而在高剂量时主要以坏死方式死亡［2］。
神经节苷脂（GM1）又称单唾液酸神经节苷脂，是一类酸性鞘糖脂，由鞘氨醇、脂肪酸及含唾液酸的糖链三部分组成，广泛分布于脊椎动物各组织的细胞膜上，其中以神经系统含量最为丰富。众多研究表明，神经节苷脂在神经系统发育过程中，不论在类型上还是在含量上均有显著的变化。GM1能抑制神经细胞DNA的合成，诱导神经细胞分化。娄季宇等［3］研究发现GM1可能增强了脑缺血后RHR缺血区神经元细胞的DNA修复能力而抑制DNA片断化损伤，进而阻止了神经细胞的凋亡。神经细胞诱导分化过程中伴随有核膜GM1含量的增高。体内与体外实验表明，GM1是目前公认的一种兴奋性氨基酸受体过度拮抗剂，GM1或其半合成衍生物预处理体培养的小脑颗粒细胞可减少谷氨酸引起的迟发性神经元死亡。胡志兵等［4］认为GM1能降低突触间隙中谷氨酸浓度，一方面是通过减少其释放，另一方面可能是通过保护谷氨酸神经元和提高谷氨酸转运体Ⅲ的表达，促进谷氨酸的回收利用而起到神经保护作用的。
3.2 GM1对谷氨酸损伤体外培养脊髓GAP-43 mRNA和NF-L mRNA表达的影响的可能机制
关于GM1对神经元细胞的影响，国内外均有报道［3-6］，但其阐述的作用机制却不尽相同，本研究通过GM1对谷氨酸损伤体外培养脊髓GAP-43 mRNA和NF-L mRNA表达的影响来进一步探索其可能的机制。生长相关蛋白(GAP-43)是一种胞膜磷酸蛋白质，广泛分布于大脑、小脑、海马以及脊髓、背根神经节和自主神经系统。近年来发现神经胶质细胞、少突胶质细胞、雪旺细胞均能表达GAP-43。作为快速转运蛋白的GAP-43起初位于胞体，随着细胞突起的延长而逐渐趋向于突起，最后集中在生长锥［7］。当神经元的突起相互接触时，GAP-43的表达抑制。由于GAP-43 mRNA同时受转录调节和蛋白质半衰期以及GAP-43合成后迅速转运至生长锥的影响。神经丝(Neurofilament,NF)属于中间丝家族的第Ⅳ型，广泛分布于成熟神经元中。神经丝由高分子量的神经丝(High molecular weight neurofilament,NF-H)，中分子量神经丝(Middle molecular weight neurofilament,NF-M)和低分子量神经丝(Low molecular weight neurofilament,NF-L)三个亚单位组成。
有研究表明，神经元的细胞骨架对维持神经元细胞独特的形态特征，神经系统正常活动必需的轴浆运输现象以及神经再生与损伤后修复有着至关重要的作用［8］。本研究结果表明，GM1作用于体外培养的脊髓的过程中，GAP-43mRNA和NF-L mRNA表达与谷氨酸损伤组、对照组比较差异有统计学意义；体外原代培养的神经元本身就是对培养神经细胞的一种刺激，能产生较多新的神经元生长锥，轴突增加，从而造成GAP-43mRNA和NF-L mRNA表达的增加，维持神经和促进细胞突起的形成。但是谷氨酸对体外培养的脊髓的造成损伤，影响了细胞突起的形成，神经元再生能力遭到破坏，因此GAP-43mRNA和NF-L mRNA表达减少，我们能观察到的是细胞的突起减少或断裂。应用GM1后，对脊髓的再生起到一定的保护作用，促进了GAP-43mRNA和NF-L mRNA表达增加，我们观察到的是细胞的突起增多，胞体饱满，生长锥增多。应用GM1的GAP-43mRNA和NF-L mRNA表达均好于谷氨酸损伤对照组，也从另一个侧面证明了GM1对体外培养谷氨酸损伤脊髓的保护作用。
本研究表明GM1对于谷氨酸造成的体外培养的脊髓损伤后的再生以及防止神经元坏死起到保护作用；GM1将会有效地防止由兴奋性谷氨酸的造成的损伤，为临床上治疗神经元的损伤提供了可靠的依据。
参考文献
［1］张红旭，胥少汀，吴霞，等.肌膜管结合神经营养因子修复脊髓缺损的实验研究［J］.中华骨科杂志，1995，15(1)：32-35
［2］Klein R,Jing SQ,Nanduri V,et al.The trk proto-oncogene encodes a receptor for nerve growth factor［J］.Cell,1991，65(1)：189-197
［3］娄季宇，王景涛，白宏英，等.GM1对高血压大鼠脑缺血再灌注后DNA损伤修复的影响［J］.中国实用神经疾病杂志，2006，9（1）：2-5
［4］胡志兵，陆雪芬，郑德枢.神经节苷脂GM1对缺血缺氧后谷氨酸及其转运体神经元的作用［J］.中国临床药理学与治疗学，2004，9（1）：83-86
［5］Ryu BR,Choi DW,Hartley DW,et al.Attenuation of cortical heuronal apoptosis by gangliosides［J］.J Pharmacol Exp Ther,1999,290：811-816
［6］Tseng EE,Brock MV,Lange MS,et al.Monosiologanglioside GM1 inhibits neurotoxity after hypothemic circulatory arrest［J］.Surgery,1998,124:298-306
［7］陈龙菊,李峰, 刘娜, 等.臂丛损伤脊髓运动神经元与神经根gap-43mRNA表达［J］.中国临床解剖学杂志,2005,23(6):639-642
［8］米瑞发,周长满,范明.大鼠坐骨神经损伤后背根节感觉神经元神经丝蛋白基因表达的变化［J］.解剖学报,2001,32(4):324-328
山东省滨州市，滨州医学院