人脂肪基质细胞体外分离与培养的实验研究

　　关键词  人脂肪基质细胞;组织分离；细胞培养

　　摘要  目的  探讨人脂肪基质细胞体外分离与培养，为其将来应用于组织工程提供基础。方法  通过外科手术获得腹部皮下的脂肪组织，进行体外分离培养脂肪基质细胞，并在相差显微镜下每日观察、记录人脂肪基质细胞的生长状况，并用CCK-8测定其生长生活。结果  人脂肪基质细胞呈现梭形外观，增殖旺盛，体外容易扩增。结论  我们建立了一种自人体脂肪组织分离、培养人脂肪基质细胞简便稳定的方法，为其应用于组织工程提供了基础。

　　ISOLATION AND CULTIVATION OF HUMAN ADIPOSE-DERIVED ADULT STROMAL CELLS IN VITRO 

　　Ye Xinchun,Liu Bin,Wang Ruimin.

　　Department of Neurology,The Affiliated Hospital of North China Coal Medical College,Tangshan 063000,China

　　Key words  adipose-derived adult stromal cells; tissue isolation; cell culture

　　Abstract  Objective  To establish an approach for isolation and cultivation of human adipose-derived adult stromal (ADAS) cells in vitro. Methods  The adipose tissue was obtained from the omentum of abdominal surgery patients under the aseptic condition, then it was isolated and cultured in vitro. The phase-contrast microscope was used to observe human adipose-derived adult stromal cells every day and the viability of human adipose-derived adult stromal cells was assessed by CCK-8. Results  Human adipose-derived adult stromal cells appeared as a monolayer of spindle-shaped, fibroblastic cells with active proliferation，and they can proliferated easily in vitro. Conclusion  A simple and stable method for isolation and cultivation human adipose-derived adult stromal cells is successfully established , which provides the foundation for future usage of human ADAS cells in tissue engneering.

　　以美容为目的的脂肪组织切除术诞生于100多年前［1］。在过去的20年抽脂术应用的报道很快增多［2，3］，美国每年有375 000例患者进行抽脂术，每次手术可以产生几百毫升到几升的抽吸物，通常这些抽吸物被当作垃圾处理。目前已经有许多研究机构从这些“垃圾”中分离出细胞，这些细胞就是脂肪组织来源的基质细胞(adipose-derived adult stromal cells,ADASc)，其具有多向分化的潜能，因此ADAS细胞已成为组织工程、细胞治疗、基因治疗等方面的研究热点。本实验旨在探讨分离培养扩增人脂肪基质细胞（human adipose-derired adult stromal cells,huADASc）的方法, 并观察体外huADAS的生长形态及增殖情况。

　　1  材料与方法

　　1.1  脂肪组织  通过外科手术获得腹部皮下的脂肪组织。脂肪组织供体来自华北煤炭医学院附属医院妇产科的孕妇，年龄20～35岁。

　　1.2  主要试剂  高糖DMDM培养基（Sigma,USA）；F12培养基（Gibco,USA）；标准胎牛血清FBS（天津TBD）；胰蛋白酶（Hyclone,USA）；EDTA（Sigma,USA）；Ⅰ型胶原酶（Sigma,USA）；CCK-8（Dojindo,Japan）。

　　1.3  方法

　　1.3.1  huADASc的获得和培养  通过外科手术获得腹部皮下的脂肪组织。术前检查已经排除内分泌疾病和传染病，将脂肪组织用D-Hank’s液浸泡，4℃保存，离体脂肪组织1h内送达实验室进行下一步实验。

　　1.3.2  机械分割  在超净工作台中将离体脂肪组织用D-Hank’s液（含100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素）反复冲洗至少3次，移除红细胞,100目筛网过滤，机械分割成1mm×1mm×1mm细小组织。

　　1.3.3  组织消化  将机械分割后的约40ml的脂肪中加入同等体积250U/ml Ⅰ型胶原酶消化液（250U/ml Ⅰ型胶原酶，2%BSA）,37℃恒温搅拌60min,离心200g×10min,吸除表面漂浮的脂肪组织。

　　1.3.4  裂解红细胞  将离心沉降的细胞团用RBC裂解液重新悬浮并静置10min,裂解收集细胞中的红细胞。

　　1.3.5  洗涤胶原酶及裂解液残余  用D-Hank’s缓冲液重新悬浮并吹打细胞，低速离心200g×10min以充分去除胶原酶及裂解液残余。

　　1.3.6  huADASc接种和传代  将DMEM/F12培养基加入细胞, 并吹打细胞至悬浮,DMEM/F12培养基中含有10%的FBS,100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素,80目筛网过滤。台盼蓝染色测定细胞活力，取0.4%台盼蓝0.5ml、DMEM/F12培养基0.3ml和细胞悬液0.2ml（约106/ml）充分混匀，用血球计数板计数活细胞(未着色细胞)和死细胞(着色细胞)，共计数500 个细胞，计算细胞活力。细胞活力(%)=(细胞总数－着色细胞数)÷细胞总数×100%。调整细胞密度，种植到T25的培养瓶中于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，种植密度约8 000~10 000cells/cm2。24h后首次换液，弃掉未贴壁细胞。以后每3d换1次液，此时细胞为0代。当细胞生长至70%~80%融合时传代，用0.5mM EDTA/0.05%胰蛋白酶37℃消化细胞3~4min，离心200g×10min, 细胞稀释2倍传至培养瓶中培养，隔天换液。所有实验用的细胞是在细胞传代到第四至第五代间进行。

　　1.3.7  倒置相差显微镜观察  倒置相差显微镜下逐日观察原代及传代细胞的生长情况和形态变化。

　　1.3.8  huADASc生长曲线的测定  培养细胞传代到第三代达70%~80%以上融合后,用D-Hank’s冲洗,0.5mMEDTA/0.05%胰蛋白酶消化细胞,并以种植密度约8 000~10 000cells/cm2种植到96孔板，分别培养1,2,3,4,5,6,7d,每天各取3孔加入CCK-8，每孔加入10μg/L,并放回37℃ CO2孵养箱2h,每天各取6孔,用microtiter plate reader测量OD450，取其平均值，同时每次在空白对照孔里加入培养基和CCK-8，也进行测量OD450的值，每天实测的OD450是用实验孔减去对照孔，以培养时间为横轴，OD450值为纵轴，绘制huADAS细胞生长曲线。

　　2  结果

　　2.1  倒置相差显微镜观察原代培养细胞  刚分离接种的细胞镜下呈圆形，悬浮状态，混有少量内皮细胞、平滑肌细胞、血管周细胞、周皮细胞、成纤维细胞等，细胞大小不一，数目较多，随培养时间的延长,这些杂质细胞随传代和换液次数的增多而被清除。接种后24h内,体积较大的细胞大多已贴壁,并开始伸展,多呈梭形,有的呈圆形或多角形。有粗大突起伸出，核居中，有1～2 个核仁，48h后贴壁细胞开始分裂增殖，多呈梭形外观，1周后，细胞融合成单层，排列出现方向性，但有少量圆形及卵圆形细胞混杂生长（图1）。

　　图1  原代ADAS细胞培养7d（×40）（略）

　　2.2  传代培养  刚传代的细胞呈圆形,很快贴壁，伸展为三角形、多角形,并逐渐变成梭形,少部分圆形悬浮细胞,折光性差,随换液去除, 传代细胞24h内完全贴壁，贴壁细胞均匀分布, 恢复原来形态，3~5d迅速增殖，约6~7d长满培养瓶底（图2）。经过4到5次传代,细胞呈更均匀有序的成纤维细胞样分布,与原代培养细胞相比较，这些细胞相对己纯化，细胞形态单一。

　　图2  传代ADAS细胞长至第七天（×100）（略）

　　2.3  细胞的生长曲线  传代细胞的生长较原代要快,一般6d左右能达90%以上融合,从生长曲线上看，细胞生长较好，形态、大小较规整，传代细胞比原代细胞增殖更快。潜伏适应期在第一至二天(约24h), 随后进入快速增长的对数增殖期，对数生长期为第三至五天(约72h),以后进入平台期,传代周期约6-7d（图3）。

　　图3  HuADAS细胞的生长曲线（略）

　　3  讨论

　　自1998年成功分离人类胚胎干细胞以来，干细胞由于其分化为多种组织细胞的能力以及潜在的临床应用价值引起了世界的关注。近年来随着基因技术和细胞技术的发展，利用干细胞治疗疾病的尝试已经开始，中枢神经系统疾病如帕金森病（Parkinson’s disease,PD）,遗传性进行性舞蹈病（Huntington’s disease,HD），脑卒中等的细胞移植治疗在基础实验研究和临床研究上都已经获得一定的疗效，但存在以下问题：①取材困难, 如神经干细胞取材时容易造成周围神经组织的功能损伤；②细胞来源不足，例如每个患者若要达到细胞移植治疗目的，所需细胞数量至少需要5个胚胎才能得以满足，因此难于广泛应用；③异体来源的材料移植后存在免疫排斥反应；④有关的伦理学争议。因此，自体来源、数量充足、可反复取材、在体内外易于扩增的“种子细胞”不易获得,使细胞移植治疗一直未在临床上得到广泛应用。未来的细胞治疗和组织工程主要应用自体的多能干细胞作为种子细胞，其中一种种子细胞来源是骨髓基质，骨髓腔中含有几种细胞成分，其中间充质干细胞能分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞和成肌细胞［4］，但骨髓的抽取往往给患者造成痛苦，且来源有限,每个成人每次只能抽取10～20 ml骨髓，所以其广泛应用受到限制。另外一种潜在的自体干细胞来源于脂肪组织，它的获取相对容易，我们称之为脂肪基质细胞。20世纪60年代，Rodbell首先建立了从啮鼠动物的脂肪组织中分离细胞的方法［5］。主要内容是切碎组织，胶原酶消化，随后离心去除表面漂浮的脂肪组织,获得基质血管层(Stromal vascula fraction,SVF)。这种方法修改后已经被一些研究机构成功地应用于人ADAS细胞的分离培养［6］。此时huADAS细胞可混有内皮细胞、平滑肌细胞、血管周细胞、周皮细胞、成纤维细胞等，但是这些细胞的量相当少。HuADAS细胞在体外的生长状态类似成纤维细胞，同时还可见圆形或多角形细胞［7，8］。Kang等［9］的研究表明细胞换液和传代过程中可以起到纯化细胞的作用，传代到第三代的huADAS细胞已经基本没有杂质细胞。HuADAS细胞原代培养时, 胶原酶的浓度和消化时间是关键因素［10］。如果消化时间过长或者浓度过高会导致huADAS细胞的贴壁性差；如果消化时间过短或者浓度过底会导致huADAS细胞和脂肪组织中的I型胶原成分没有充分分离出来。不同厂家的胶原酶活力会有明显不同，因此本实验中采用标准单位浓度而非质量浓度，把胶原酶配置成250U/ml，消化60min；红细胞是另一个影响细胞贴壁的重要因素［10］，Harmelen等［10］实验表明使用红细胞裂解液可以消除红细胞对huADAS细胞的影响，同时其并不影响huADAS细胞的贴壁性和分化能力。HuADAS细胞没有特异性标志是公认的，目前应用流式细胞技术，免疫细胞化学技术已经成功地鉴定出分离的未分化的huADAS细胞的相关表面标记物。其中阳性表达物有CD9,CD10,CD13,CD29,CD341,CD44,CD49d,CD54,CD55,CD59,CD71,CD73,CD90,CD105,CD106,CD146,CD166,α-平滑肌肌动蛋白,Ⅰ型胶原,Ⅲ型胶原,HLA-ABC,骨桥蛋白,波形蛋白；阴性表达物有CD11,CD14,CD16,CD18,CD31,CD45,CD50,CD56,CD62,CD104,FVⅢ相关抗原,HLA-DR,Stro-1。这些由不同的研究机构发现的表面标记物很多相互一致，但是不完全相同，可能与成体脂肪基质细胞分离方法微小差异，ADAS细胞在培养基的培养时间不同所致以及消化组织时胶原酶的选择，纯度和浓度有关［6］。ADAS细胞是来源于中胚层的干细胞，具有很强的活力，细胞衰老水平低。根据报道这一点可以从β-gal染色分析可以得知，在pH 6.0的情况下，衰老细胞表达β-gal，而增殖的细胞不表达β-gal。ADAS细胞从第一到第十五代之间的每代都进行β-gal染色并进行分析。在第一代没有见到β-gal染色的阳性细胞。随后β-gal染色阳性的细胞随着细胞传代代数的增加而增多。但是10代以内的β-gal染色阳性细胞数<5%。15代之内的β-gal染色阳性细胞数低于15%。因此ADAS细胞可以在体外长期相对稳定地进行培养［7］。生长曲线分潜伏适应期、对数生长期和平台期，这些时期每个细胞系都有其特性，生长曲线的测定对于设计常规传代以及实验方案非常重要，从其形状可获得培养物繁殖潜力的信息。实验发现huADAS的生长性状稳定,潜伏适应期1～2d(约48h),对数生长期3～5d(约72h),传代周期约6～7d。经过3次传代的huADAS适应能力强，增殖速度快，体外扩增容易，有巨大的扩增潜能。最近研究已经发现在脂肪中存在脂肪基质细胞，可以转化成成骨细胞，软骨细胞，肌细胞，心肌细胞和脂肪细胞等细胞［6］，因此可作为组织工程的种子细胞、细胞治疗和基因治疗的载体，用于为临床治疗。

　　4  参考文献
 
　　［1］  Billings E Jr,May JW Jr.Historical review and present status of free fat graft autotransplantation in plastic and reconstructive surgery［J］.Plast Reconstr Surg,1989,83(2):368-381
 
　　［2］  Ellenbogen R.Free autogenous pearl fat grafts in the face-a preliminary report of a rediscovered technique［J］.Ann Plast Surg,1986,16(3):179-194
 
　　［3］  von Heimburg D,Pallua N.Two-year histological outcome of facial lipofilling［J］.Ann Plast Surg,2001,46(6):644-646
 
　　［4］  Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells［J］.Science,1999,284(5411):143-147
 
　　［5］  Rodbell M.Metabolism of isolated fat cells. I. Effects of hormones on glucose metabolism and lipolysis［J］.J Biol Chem,1964,239:375-380
 
　　［6］  Gimble JM,Guilak F.Differentiation potential of adipose derived adult stem (ADAS) cells［J］.Curr Top Dev Biol,2003,58:137-160
 
　　［7］  Zuk PA,Zhu M,Mizuno H,et al.Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies［J］.Tissue Eng,2001,7(2):211-228
 
　　［8］  Zuk PA,Zhu M,Ashjian P,et al.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells［J］.Mol Biol Cell,2002,13(12):4279-4295
 
　　［9］  Kang SK,Lee DH,Bae YC,et al.Improvement of neurological deficits by intracerebral transplantation of human adipose tissue-derived stromal cells after cerebral ischemia in rats［J］.Exp Neurol,2003,183(2):355-366

　　［10］  Van Harmelen V,Skurk T,Hauner H.Primary culture and differentiation of human adipocyte precursor cells［J］.Methods Mol Med,2005,107:125-135

　　063000  河北省唐山市，华北煤炭医学院附属医院神经内科 

　　　　　　华北煤炭医学院中心实验室