液相芯片技术一步反应法联合定量测定人血清CEA、AFP和tPSA

【摘要】  目的 建立用液相芯片技术同时定量测定人血清中癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）和总前列腺特异性抗原（tPSA）水平的一步反应法，并对该方法进行评价。方法 制备抗体交联微球及生物素标记抗体，用双抗体夹心法测定临床血清标本。结果 联合测定CEA、AFP和tPSA的线性范围分别为0.063～200 ng/ml、0.052～66.6 ng/ml、0.016～20 ng/ml； 最低检测限分别为31.3 pg/ml、26.0 pg/ml、7.8 pg/ml； 批内精密度<10 %，批间精密度<14 %； 血清标本CEA、AFP和tPSA检测值与化学发光免疫分析法（CLIA）测值的相关系数为0.920～0.940，与液相芯片两步反应法测值的相关系数为0.952～0.979。该方法仅需1 μl标本，2 h即可完成检测。结论 液相芯片一步反应法具有高通量、检测范围广、灵敏度高、重复性好、节省样品和时间等优点，具有较大临床应用潜力。

【关键词】  液相芯片； Luminex； 肿瘤标志物

Simultaneous Quantitative Determination of Carcinoembryonic Antigen (CEA),Alpha Fetoprotein (AFP) and Total Prostate Specific Antigen (tPSA) in Human Serum by Onestep Luminex Assay

    CHEN Wei1,LI Miaoyan2,LI Ming2

    (1.Department of Pathology,Chengdu Medical College,Chengdu 610083;2.Guangzhou Darui Antibody Engineering Co.Ltd,Guangzhou 510663,China)

    【Abstract】  Objective To establish a onestep assay to simultaneously quantify carcinoembryonic antigen (CEA),alpha fetoprotein (AFP) and total prostate specific antigen (tPSA) in human serum using multiplexed Luminex assay and evaluate its assay performance.Methods Antibodyconjugated microspheres and biotinylated detection antibodies were prepared.A sandwich immunoassay was established to measure the levels of CEA,AFP and tPSA in clinical serum samples.Results The linear range for the measurement of CEA,AFP and tPSA was 0.063～200 ng/ml,0.052～66.6 ng/ml,0.016～20 ng/ml,respectively.The lower detection limit of CEA,AFP and tPSA was 31.3 pg/ml,26.0 pg/ml,7.8 pg/ml,respectively.The intra and interassay coefficients of variation were less than 9 % and 14%.The correlation coefficients (r) of measurement of CEA,AFP and tPSA were 0.920～0.940 compared with chemiluminescence immunoassay (CLIA),and 0.952～0.979 compared with the twostep Luminex assay.In addition,only 1 microliter of serum and 2 hours were required for the assay.Conclusion With the advantages of unique capability of multiplexing and highthroughput,good reproducibility,increased detection range and sensitivity,the onestep Luminex assay would have great potential in future clinical application.

    【Key words】  suspension bead array； Luminex； tumor markers

      肿瘤标志物在肿瘤的临床诊断和治疗中占有重要地位。由于数种肿瘤标志物联合检测对肿瘤的早期诊断及疗效监测更具价值，而同时检测多项指标依靠传统检测手段无法实现，因此在实际工作中亟需一种能够同时完成多指标检测的新型试剂。液相芯片是一种新型生物芯片技术平台，它在不同荧光编码的微球上进行抗原抗体及核酸杂交反应，通过两束激光分别检测微球编码和荧光信号以达到定性和定量分析目的。除了具有快速、灵敏、灵活、准确等显著特点外，液相芯片的最大优势在于高通量，即可同时对同一样本中多达100种目的分子进行分析［1］。作者已应用液相芯片技术建立了联合检测人血清中癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）和总前列腺特异性抗原（tPSA）水平的两步反应法（即第一步在标准品或血清标本孔中仅加入稀释微球混合液孵育60 min，待抽滤、洗涤后再加入生物素标记抗体混合液继续第二步孵育60 min，研究待发表），为进一步缩短检测时间和简化操作步骤，本研究中作者采取一步反应法同时定量测定了人血清CEA、AFP和tPSA水平，评价了该方法的检测范围、最低检测限、精密度等指标，并将用该方法得到的临床血清标本检测值与化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA）和液相芯片两步反应法的测值进行了相关性分析。

    1  材料与方法

    1.1  材料和仪器

    所有单克隆抗体均购自芬兰Medix公司，抗原均购自美国Biodesign公司，羧基化微球购自美国Luminex公司，多孔滤膜板（MultiScreen MABVN 1.2 μm）和真空抽滤装置购自美国Millipore公司，BioPlex检测系统购自美国BioRad公司。CEA/AFP、tPSA阴性和阳性血清标本（经Bayer全自动化学发光免疫分析仪检测）来自解放军301医院、南方医院。

    1.2  微球的交联

    按文献［2］的方法分别制备交联CEA、AFP和tPSA包被抗体的微球。

    1.3  抗体的生物素标记

    按文献［2］的方法分别制备生物素标记的CEA、AFP和tPSA检测抗体。

    1.4  抗原标准品的制备

    用标准品稀释液（75 mg/ml BSA，0.01% Tween 20，0.01 mol/L叠氮钠，0.01 mol/L PBS，pH 7.4）配制同时含有CEA、AFP和tPSA三种抗原的不同浓度水平的标准品。

    1.5  操作方法

    具有不同编码的抗体交联微球各取适量，用分析缓冲液（10 mg/ml BSA，0.01 mol/L叠氮钠，0.01 mol/L PBS，pH 7.4）配制成每微升含有80个各编码微球的稀释微球混合液。多孔滤膜板各孔中加入100 μl分析缓冲液预湿，真空抽滤去除液体，在标准品孔和样品孔中分别加入25 μl/孔的标准品和血清标本（血清标本预先用分析缓冲液稀释25倍），然后每孔先后加入25 μl稀释微球混合液及25 μl生物素标记抗体混合液（各抗体浓度为1～2 μg/ml），室温避光振荡孵育60 min或90 min.真空抽滤去除孔内液体，每孔用100 μl洗涤液（0.05% Tween 20，0.01 mol/L PBS，pH 7.4）洗涤3次，然后每孔加入25 μl藻红蛋白标记的链霉亲和素（SAPE，20 μg/ml），室温避光振荡孵育20 min。再次抽滤并洗涤3次后，每孔加入125 μl洗涤液重悬微球，在BioPlex检测系统上读取各孔荧光值。

    1.6  评价指标

    1.6.1  检测范围  配制含不同浓度水平CEA、AFP、tPSA的标准品，按1.5操作先后与抗体交联微球混合液、生物素标记抗体混合液和SAPE反应后，测定荧光值，得出各抗原的标准曲线。

    1.6.2  最低检测限  测定20个空白孔的荧光值，计算其平均值（）及标准差（s）。荧光值等于+2 s时的抗原浓度水平即为各抗原的最低检测限。

    1.6.3  精密度  选取3个CEA/AFP、tPSA阳性血清标本进行测定。考察批内精密度时，3个血清各设8个复孔； 考察批间精密度时，3个血清各测3次，每次各设8个复孔，计算CEA、AFP、tPSA水平的、s及变异系数（CV）。

    1.6.4  与CLIA和液相芯片两步反应法血清检测结果的比较  用液相芯片一步反应法测定30份CEA/AFP和41份tPSA临床血清标本，并将其测值与CLIA和两步反应法的测值进行配对t检验和线性相关回归分析。

    1.7  统计学处理

    使用SPSS 13.0软件进行统计学分析，P < 0.05有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  反应时间的优化

    将CEA、AFP和tPSA的抗体交联微球、抗原标准品与标记抗体按一步反应法共同孵育60 min或90 min，抽滤、洗涤后再加入SAPE孵育20 min，从得到的标准品荧光值（见表1）可看出（以CEA为例），与孵育60 min相比，反应时间为90 min时的标准品荧光值更高，而背景信号更低，因此我们在后续实验中采取共同孵育90 min.表1  一步反应法采用不同反应时间所测CEA标准品的荧光值

    2.2  检测范围

    一步反应法联合检测CEA、AFP、tPSA的标准曲线见图1.CEA、AFP、tPSA标准曲线的线性范围分别为0.063～200 ng/ml、 0.052～66.6 ng/ml、 0.016～20 ng/ml，即分别达到3.5、 3.1、 3.1个对数值； 其动态范围分别为0.031～400 ng/ml、 0.052～200 ng/ml、 0.016～60 ng/ml，即分别达到4.1、 3.6、 3.6个对数值。

    2.3  最低检测限

    一步反应法联合检测CEA、AFP、tPSA的最低检测限分别为31.3 pg/ml、26.0 pg/ml、7.8 pg/ml.

    2.4  精密度

    测定3个阳性血清标本，得出一步反应法联合检测CEA、AFP、tPSA的批内CV为6.2%～9.7%，批间CV为6.2%～13.7%，说明具有较好的重复性（见表2、3）。

    2.5  与其它方法检测结果的比较

    采用一步反应法测定临床血清标本的CEA、AFP、tPSA水平，并与两步反应法及CLIA的检测结果进行统计学分析。结果表明，尽管一步反应法的测值大多高于两步反应法的测值，但配对t检验显示一步反应法与两步反应法、CLIA的测定结果在统计学上无显著性差异（P>0.05）； 线性相关回归分析表明，三种方法所得测值之间的相关系数（r）为0.920～0.979，说明具有良好的线性相关关系（见表4）。表2  一步反应法联合检测CEA、AFP、tPSA的批内精密度表3  一步反应法联合检测CEA、AFP、tPSA的批间精密度表4  液相芯片一步反应法与两步反应法、CLIA血清检测值的统计学分析结果

    3  讨  论

    肿瘤标志物对于肿瘤普查、诊断、分期、疗效监测及预后判断等具有重要价值，为提高肿瘤诊断的阳性率和特异性，临床上常联合检测多种标志物，但目前常用的检测手段如放射免疫测定、酶联免疫测定、化学发光及时间分辨荧光免疫分析等每次仅能检测一种指标。

    　　液相芯片是20世纪90年代中期发展起来的被喻为后基因组时代的芯片技术，它是一种可进行蛋白、核酸等生物大分子检测及酶学分析、受体和配体识别分析等研究的多功能技术平台。该技术主要通过可偶联探针的荧光编码微球与红绿两束激光检测实现对被测物的定性和定量分析，一个反应孔内可以完成100种不同的生物学反应［3,4］。与常规检测方法相比，液相芯片技术具有几大显著优点：高通量，可对同一样本中的多种不同目的分子同时进行分析，大大提高工作效率； 液相环境更有利于保持生物大分子的天然构象，也更有利于反应进行； 灵敏度、准确性高，重复性、灵活性好； 只需要微量的样品即可进行检测［5,6］。目前国外有越来越多的学者将液相芯片技术用于基础研究和临床诊断领域中，包括检测细胞因子、过敏原、自身抗体、激素、SNP以及感染性疾病诊断、HLA分型、基因表达分析等［710］。

    　　为利用液相芯片技术的高通量优势，开发出可联合检测多种肿瘤标志物、以期早期发现肿瘤的诊断试剂，作者对联合检测CEA、AFP、tPSA这三种临床常用肿瘤标志物的方法进行了初步研究。在已建立同时定量测定人血清CEA、AFP、tPSA水平的两步反应法的基础上，本研究采用一步反应法进行定量测定。其检测范围广，线性范围达到3.1个对数值以上，超过了CLIA（为2.8～3个对数值），动态范围达到3.6个对数值以上； 最低检测限为7.8～31.3 pg/ml，也大大优于CLIA（分别为90～900 pg/ml）。宽检测范围和高灵敏度确保了含极高或极低水平被检物的血清标本也可被检出。一步反应法的批内和批间精密度低于14%，具有较好的重复性，临床血清测值与CLIA之间呈线性相关关系，相关系数在0.920以上。液相芯片法仅需要1 μl标本即可在2h左右同时完成三种肿瘤标志物的检测，较之CLIA（需要50～60 μl标本）大大节约了试剂、标本用量、人力以及操作时间，因此是一种优于传统检测技术的快速、高通量、多样本检测手段，具有较大的临床应用潜力。

    　　与抗体交联微球和生物素标记抗体分步加入的两步反应法相比，一步反应法同时加入交联微球、生物素标记抗体进行孵育，可将完成检测的时间缩短约40 min，且在设定的抗原标准品浓度范围内未见Hook反应，但其荧光背景比两步反应法稍高，AFP和tPSA的动态范围略有减小，检测灵敏度稍降。尽管一步反应法的血清测值偏高，但与两步反应法测值之间存在良好的相关性。鉴于一步反应法在操作上的简便、快速性，我们考虑可进一步优化其反应条件，如生物素标记抗体及SAPE浓度。

    　　下一步作者还将通过大样本测定正常人血清CEA、AFP、tPSA水平而确定一步反应法联合检测三项肿瘤标志物的正常值，并以CLIA为金标准，研究一步反应法的检测灵敏性、特异性和准确性。

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