一个植物乳杆菌隐蔽质粒的测序和注释

【摘要】  在植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum CICC 6002）中发现了1个隐蔽质粒（pLP2111），并将其克隆到pUC 18质粒上进行测序。序列分析表明pLP2111大小为2 111 bp； 仅有1个ORF，编码1个37.0 kDa的复制蛋白； 有1个17 bp的重复序列重复了13次。BLAST结果显示pLp 2111和植物乳杆菌CCM 1904菌株的pLP1质粒相似性最高，为99 %，pLP2111比pLP1大18 bp.pLP2111可能构建为良好的乳杆菌或乳球菌异源蛋白表达载体。

【关键词】  植物乳杆菌； 隐蔽质粒； 测序； 注释

    Complete DNA Sequence and Analysis of a Cryptic Plasmidisolated from Lactobacillus Plantarum

    PAN Qu1，3，HU Yuan2，DENG Lin2，LEI Shun2，HU Xiaomei1，HU Fuquan1*

    （1.Department of Microbiology，Third Military Medical University， Chongqing 400038,China； 2.Major of biotechnology，Grade 2005,Third Military Medical University， Chongqing 400038,China ； 3.Department of Microbiology,Chengdu Medical College， Chengdu 610083,China）

    【Abstract】  The complete nucleotide sequence of a cryptic plasmid isolated from Lactobacillus plantarum strain CICC 6002 has been determined.The plasmid,designated pLP2111,has 2,111 bp,encodes a 37.0 kDa Rep protein and has a 17 bp sequence repeated 13 times.The result of BLAST showed that pLP2111 is 99 % identical to pLP1 (2,093 bp) of Lactobacillus plantarum strain CCM 1904.The pLP2111 may be constructed as a good heteroexpression vector.

    【Key words】  Lactobacillus plantarum；   cryptic plasmid；   sequence;  analysis

    植物乳杆菌作为乳杆菌的一员，具有增强机体免疫力、降低机体胆固醇水平、帮助消化和维持肠道微生态平衡的生理功能，对人体健康有益； 而且该菌已被广泛用于青贮饲料、肉类和蔬菜的乳酸发酵中。目前，其基因工程改造是研究热点，例如将其改造为可口服的疫苗投送载体和酶投送载体。但是，由于乳杆菌转化效率远低于大肠杆菌，导致其转化成功率低、重复性差，成为基因工程改造的难关。寻找新的质粒，从而构建转化率高的表达载体是促进乳杆菌基因工程发展的方法之一。

    自从1976年Chassy［1］首次在乳杆菌中发现质粒以来，已经有上百个乳杆菌质粒被发现，大小从几千个碱基对到几十万个碱基对都有，其中多数为隐蔽性质粒，少数质粒与某些表型，如抗药性、糖苷代谢、糖代谢、氨基酸代谢、细菌素产生与免疫等密切相关。在Genbank数据库中，登录有13个植物乳杆菌质粒的完整序列（见表1）。发现新的质粒对植物乳杆菌分子生物学的研究有重要的意义，尤其在构建新的植物乳杆菌表达载体上。

    本研究从植物乳酸杆菌CICC 6002菌株中分离了一个隐蔽性质粒，并进行了测序和注释工作，该质粒有可能构建为良好的表达载体。

　　1  材料和方法

    1.1  菌株和质粒

    植物乳杆菌CICC 6002菌株购自中国工业微生物菌种保藏中心。培养条件为：在37 ℃下，于MRS培养液［11］中静置培养24 h.大肠杆菌DH5α菌株由本实验室保存，培养条件为：在37 ℃下，于LB培养液培养过夜。质粒PUC 18为本实验室保存。表1  在植物乳酸杆菌中发现的质粒列表

    1.2  质粒提取

    离心收集植物乳杆菌CICC 6002的菌体，用华舜质粒提取试剂盒（华舜，上海）提取质粒。不同于说明书的步骤是：用GTEL溶液（葡萄糖 50 mmol/L ，TrisCl  25 mmol/L，EDTA  10 mmol/L，溶菌酶 10 mg/mL，pH 8.0）代替solution I重新悬浮菌体，并在37 ℃温育15 min，以破坏该菌细胞壁的肽聚糖层。使用华舜胶回收试剂盒分离纯化各质粒条带。

    1.3  构建测序载体

    经预试验确定植物乳杆菌的该质粒具有一个EcoRⅠ酶切位点。对该质粒和载体质粒PUC 18使用EcoRⅠ（farmentas,MBI）分别进行酶切，并将酶切产物用T4DNA连接酶连接。连接产物电转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，电转化产物涂布于含青霉素、IPTG和XGal的LB平板上，培养18 h后挑取白色菌落培养并提取质粒。经酶切鉴定后，送上海生物工程公司测序。

    1.4  序列注释

    利用BLAST序列比对工具对Genbank数据库中所有核酸序列比对，检索该质粒和已知乳杆菌质粒的同源性。利用DNAStar软件标注该质粒可能存在的开放阅读框（ORF）。利用DNAclub软件标注该质粒的重要酶切位点。

    2  结果

    2.1  质粒提取

    电泳结果显示植物乳杆菌CICC 6002的质粒提取液有2条带（图1），分别为5 kb和1.3 kb.EcoRⅠ酶切试验表明5 kb条带不能被EcoRⅠ切开，而1.3 kb条带被切开为线状，从1.3 kb变为2.1 kb（图2）,说明这两个条带是不同的质粒。将1.3 kb条带代表的质粒命名为pLP2111.

　　2.2  测序

    构建的重组质粒PUC 18pLP2111 在EcoRⅠ酶切后，电泳显示有2.7 kb和2.1 kb两条带（图3），证明测序载体构建成功。测序结果提交Genbank，登录号为：FJ 375766.

    2.3  注释

    质粒pLP 2111的GC含量为38.3 %,BLAST比对结果显示：该质粒与质粒pLP1（GenBank number ：M 31223.1）有99 %的相似性。不同之处是质粒pLP 2111在1443～1459 bp和2051 bp处分别多出17 bp和1 bp的碱基序列（图4）。

    通过ORF搜索，发现该质粒仅有1个编码框，从262到1215共954 bp，编码1个318个氨基酸残基的复制蛋白。乳杆菌、葡萄球菌和链球菌等革兰阳性菌的许多质粒中都存在该复制蛋白。该复制蛋白属于第一复制蛋白超家族，功能为起始质粒的滚环复制。该质粒没有编码影响菌株表型的蛋白，应归为隐蔽质粒。通过重复序列检索发现该质粒有13个重复序列，从1335到1571之间，有1个17 bp的序列“cattatcatgtagtgcg”正向重复了13次，该重复序列可能和质粒的拷贝数有关。该质粒的复制起点在2068～2081之间,主要的酶切位点如图5所示。

    3  讨论

    质粒是一种资源,发现新的质粒，对于微生物的遗传研究和构建具有自主知识产权的表达载体都具有重要意义。植物乳杆菌又是公认安全的微生物，可直接口服，是食品级的微生物，是良好的生物工程菌出发菌株,但由于目前所用的载体转化效率均不高，以致于难以在植物乳杆菌中进行基因工程的操作。寻找新的质粒，并从中找到转化效率高的质粒，一直是提高乳杆菌转化效率的方法之一。本文发现的植物乳杆菌质粒pL2111可以作为构建高效率表达载体的候选质粒，对乳杆菌基因工程研究有重要意义。

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