氧化还原状态与细胞信号传导*

【摘要】  细胞内氧化还原状态的变化决定着氧化还原反应的发生方向,并通过一定的机制进行制衡。细胞膜以及细胞内分子的氧化或还原反应,导致发生结构或构象的改变,在细胞的信号转导、基因转录等过程中发挥重要的调控功能,对细胞生命活动产生着重要的影响。酪氨酸蛋白激酶与磷酸酶、丝苏氨酸激酶与磷酸酶、磷脂酶及其代谢产物、钙离子等重要信号分子可通过氧化还原反应介导细胞信号的传导。细胞内这种氧化还原信号传导体系受到复杂而灵敏的调控。目前在分子水平上进一步认识氧化还原状态对细胞调控的机制具有重要的意义。

【关键词】  氧化还原状态; 细胞; 信号传导

Relationship Between Redox State and Cellular Signal Transduction

    LIU Yilun1, SUN Jing2, LIU Yueming1

    (1.  Department of Burn & Plastic Surgery,First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College,Chengdu 610500,China;2. Department of Pathology,Chengdu Medical College,Chengdu 610083,China)

    【Abstract】  The diection of cellular redox reaction was determined by redox state.Signal transduction,genetic transciption could be regulated by the change of cellular molecular structure through redox  reaction..Signal transduction could be mediated by redox reaction through protein tyrosine kinase/phosphatase,proteinserinethreonine kinases / phosphatase,phosholipase,calcium ion and other significant signaling molecules.The regulation of redoxsignal transduction system was sensitive and complicated.It was important to realize the regulation mechanism of redox state on cellular molecular level.

    【Key words】  redox state;  cell;  signal transduction

    氧化还原反应是生物体内普遍存在并且十分重要的生物化学反应。氧化剂与抗氧化/还原剂各自的活性与相互间的比例决定细胞内的氧化还原状态。对于细胞而言,氧化还原状态发生变化后,对细胞膜以及细胞内分子所产生的氧化或还原作用,引起结构和构象改变,在细胞的信号转导、基因转录等过程中发挥重要的调控功能。近年来,蛋白质的可逆氧化修饰日益受到重视,这类修饰不仅是调节功能的一种主要方式,而且也被看作是一种信号,包含了维持细胞稳态的调控信息 ［1,2］。目前越来越多的研究表明,这种氧化修饰可能是信号转导调控中的一种新的分子机制,成为除磷酸化修饰、糖基化修饰及泛素化修饰外的重要方式［3］。

    1  氧化还原系统的构成

    除了来自于外界的氧化剂以外,细胞自身也产生氧化剂;作为防御措施,细胞拥有有效的抗氧化/还原系统。生理条件下,细胞对氧化还原状态紧密调控,以使后者始终维持相对稳定的状态,保证细胞正常的生命活动。机体内的氧化剂主要包括活性氧（reactive oxygen species,ROS）与活性氮（reactive nitrogen species,RNS）。作为针对机体内氧化剂水平增高的防御机制,需氧生物在长期进化过程中发展出了有效的抗氧化系统,主要为酶类与非酶类抗氧化剂。酶类包括有超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、过氧化氢酶（catalase）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSHPx）以及谷胱甘肽转硫酶（glutathione Stransferase,GST）等等。非酶类抗氧化剂主要提供还原当量的各种脂溶性、水溶性化合物,主要包括有谷胱甘肽（glutathione,GSH）、硫氧还蛋白（Thioredoxin,TRX）、胡萝卜素以及维生素C与E.

    氧化还原是对机体内能够通过提供或接受还原当量的方式交换电子的一类成对分子。它们通过自身还原型与氧化型的转变,起到类似缓冲剂的作用,避免过多氧化剂或还原剂对细胞内环境的直接作用。此外,由于氧化还原对是直接应对细胞内氧化还原状态变化的物质,因而,它们的比例变化是反映氧化还原状态的可靠指标。细胞内主要的氧化还原对包括有:氧化型与还原型辅酶II (NADPH/NADP+)、氧化型与还原型硫氧还蛋白（TRXRED/TRXOX）、氧化型与还原型谷关甘肽（GSH/GSSG）。这3个氧化还原对中,GSH/GSSG所起的作用最大,其含量要比其他两个高出100倍以上,细胞内氧化还原状态的变化在很大程度上受到GSH/GSSG 的影响［4］。

    2  胞外刺激与胞内氧化还原状态

    细胞信号传导分为3个阶段:上游的跨膜信号传导,中游的胞浆信号通路,下游的核内信号传导。多种细胞信号传导通路参与细胞外刺激信号的传导。

    胞外刺激尤其是氧化还原状态的变化,能够引起细胞内氧还原状态的改变。一些氧化还原活性分子由于其本身的化学特性,能够透过细胞膜进入细胞内,从而影响细胞内氧化还原状态,这些分子包括有二硫苏糖醇、联胺以及过氧化氢等。另外一些氧化还原活性分子不能透过细胞膜,但是通过某些特定的方式,它们也能够对细胞内氧化还原状态产生相应的影响。

    细胞内GSH含量能够被胞外分子所调节。一些不能进入细胞内的氧化剂,能够使细胞内GSH水平呈剂量依赖性降低,同时细胞内蛋白分子间二硫键不断形成。胞外给予GSH,可以引起细胞内GSH水平增高,能够逆转上述氧化剂的作用。进一步研究发现,富含半胱氨酸的跨膜蛋白分子巯基/二硫化物的互换是细胞外某些氧化剂或还原剂传递给细胞内环境的中介［5］。在氧化剂或还原剂的作用下,使跨膜蛋白的巯基/二硫化物发生氧化或还原反应［6］,由此产生的巯基/二硫化物的互换能够使细胞内的GSH/GSSG氧化还原对发生相应转变。经由这样的方式,胞外氧化还原刺激就完成了对细胞内氧化还原状态的影响。

    许多细胞膜蛋白在多种刺激下能够产生过氧化氢,中性粒细胞膜上表达的NADPH氧化酶在受到细菌的攻击后所发生的防御反应,即是产生大量过氧化氢。这种“有用”的氧化剂常常产生于炎症反应过程中或者胰岛素与其受体的结合之后。值得提出的是,低剂量的过氧化氢常常作为跨膜酶蛋白催化反应的副产品而产生,例如跨膜蛋白γ谷氨酰转肽酶（γglutamyl transpeptidase,γGT）的催化反应。过氧化氢进入胞内后,NFκB被激活,许多相关基因转录激活,引起SOD以及GSH合成的关键酶γGCS等酶产生增多,通过这样的自身调节机制,细胞内氧化还原态再次达到平衡。当然,如果外界的氧化或还原刺激超过细胞的自身调节能力,则细胞发生氧化还原状态失衡。

    3  核外信号分子的氧化调控

    氧化剂通过对信号分子的氧化作用影响其结构乃至功能,从而调控该信号分子参与的信号传导通路。

    3.1  酪氨酸蛋白激酶与磷酸酶

    酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinases,PTKs)是体内重要的信号分子,能够催化底物的酪氨酸发生磷酸化。具有受体功能的PTKs又称为受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTKs)。许多生长因子对细胞的作用是始于其对RTK的激活。受体酪氨酸激酶包含有许多家族,胰岛素受体家族是其中之一,该受体与胰岛素结合后,发生自身磷酸化和胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate1,IRS1） 的磷酸化。过氧化氢、钒酸钠以及两者混合后产生的物质过钒酸钠（酪氨酸磷酸酶特异性抑制剂）具有类胰岛素效应,能够同样刺激细胞的生长和代谢。事实上,这些氧化剂的应用能够引起胰岛素受体的活化,并且使IRS1发生磷酸化。然而,胰岛素能够诱导胰岛素受体与IRS1的结合,而氧化剂却不能,提示配体与氧化剂的作用存在差别［7］。上皮生长因子和血小板源性生长因子对细胞生长的刺激作用同样是通过激活各自相应的RTKs来实现的,过氧化氢、紫外线和巯醇烷化剂碘乙酰胺（iodoacetamide,IAA）能够诱导上述受体发生磷酸化。另外,过氧化氢还可以诱导RTK下游分子SH2(Src homology region 2)蛋白Grb2与鸟苷酸交换因子SOS的复合体与EGF受体相结合,从而引起该信号传导系统的激活。

    除RTKs以外,其他 PTKs如Src等也能够被氧化应激所激活。过氧化氢、酪氨酸磷酸酶特异抑制剂过钒酸钠以及紫外线均能引起酪氨酸磷酸化,从而能够引起许多PTK的激活,其中包括Lck,Fyn和ZAP70.紫外线对ZAP70的磷酸化诱导作用依赖于CD3和CD45的参与,CD45是一种跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase,PTP）。而过氧化氢对ZAP70的磷酸化诱导作用则不需要CD45的参与。显然,过氧化氢和紫外线对细胞刺激的信号传导途径是不同的。过氧化氢能够引起Syk激活,而后者在B细胞受体介导的信号传导过程中起着关键的作用。在中性粒细胞中,Lyn,Fgr,Hck,Syk 以及 Btk等PTKs能够被氧化应激所激活,氧化还原作用还能够对Ltk这个跨膜PTK产生调控作用,IAA和联胺能够显著提高Ltk的酶活性。向小鼠腹腔内注射过钒酸钠能够引起大量蛋白发生酪氨酸磷酸化,其中包括EGF受体、胰岛素受体、肝细胞生长因子受体、转录信号传导激活蛋白（signal transducer and activator of transcription,Stat）、磷脂酶Cγ(phospholipaseCγ,PLCγ)以及 IRS1等等 ［8］。

    尽管氧化应激能够引起细胞内的PTKs活化,但是,目前仍然没有证据显示氧化剂能够直接激活PTKs.另外,氧化应激所引起的某些PTKs的激活与PTPs受到抑制有一定关系,氧化应激能够下调CD45等PTPs的酶活性。由于所有的PTPs的催化位点均含有活性半胱氨酸残基,它们在催化反应过程中形成巯基磷酸盐中间物,氧化作用对这些活性残基来说,无疑意味着其功能的丧失,因而氧化应激具有抑制PTPs的能力。细胞内蛋白的酪氨酸磷酸化水平取决于PTKs与PTPs活性的平衡状况,氧化作用诱导的PTPs的失活能够导致细胞内酪氨酸磷酸化水平明显提高。

    3.2  丝苏氨酸激酶与磷酸酶

    活化的RTKs通过激活RasRafMEK(MAPK激酶)通路,引起MAPK活化,其中Raf 与MAPK 均为丝苏氨酸激酶,而MEK是酪、苏氨酸双重激酶。活性氧能够通过相同的途径激活MAPK.过氧化氢能够引起JNK、P38以及BMK1(Big MAP kinase 1)等MAPK家族成员的活化［9］。有趣的是,氧化应激能够强烈地诱导活化一种能够将MAPK脱磷酸化的蛋白磷酸酶CL100.可以看出,对活性氧诱导的MAPK活化作用,细胞具有相应负反馈调控措施。

    Akt也是一种丝苏氨酸激酶,生长因子可通过激活磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3kinase,PI3K）来引起其活化。以过氧化氢处理细胞能够导致Akt的活化以及热休克蛋白Hsp27与它的结合［10］。另外,过氧化氢能够引起Hsp27的磷酸化,而MAPK活化蛋白激酶2（MAP kinaseactivated protein kinase2,MAPKAPK2）是Hsp27磷酸化所必需的酶,同时也能够磷酸化Akt,因此,过氧化氢很可能通过激活MAPKAPK2引起Akt和Hsp27的磷酸化。

    细胞内蛋白激酶C(PKC)的氧化还原调控较为复杂。此酶富含半胱氨酸,能够与二酰甘油（diacylglycerol,DG）或(12)十四酸佛波酯(13)乙酸盐（phorbol 12myristate 13acetate,PMA）结合而活化,并且受到多种方式调控,比如磷酸化、脂质和钙离子等。以过氧化氢处理细胞会导致细胞内PKC的激活。研究表明,过氧化氢能够诱导PKC的磷酸化,从而使酶的活性增强［11］。PKC的氨基末端调控区域含有1个锌巯基结构,其选择性氧化修饰能够激活酶的活性,与此对应的是,羧基末端的氧化修饰能够导致此酶完全失活。实验显示,低浓度的碘酸盐能够激活该酶,而高浓度的碘酸盐却使该酶失活［12］。因而,对PKC而言,氧化剂具有直接活化和抑制的双重作用。另外,氧化的DG具有激活PKC的作用［13］。总之,细胞内PKC的氧化还原调控能够通过直接氧化、磷酸化以及脂质氧化等多种方式来实现。

    值得提出的是,丝苏氨酸磷酸酶也受氧化还原作用的调控。研究表明,蛋白磷酸酶1和蛋白磷酸酶2A的巯基的氧化能够抑制酶的活性［14］。神经钙蛋白又称钙调磷酸酶,是细胞内信号传导系统中重要的一种磷酸酶,它的活性中心包含有Fe和Zn.SOD能够在体内外防止钙调磷酸酶的失活,提示含有Fe和Zn的活性中心的氧化损伤可能导致酶失活,因此,细胞内氧化还原状态对于磷酸酶的活性具有重要的影响。

    3.3  磷脂酶及其代谢产物

    生长因子通过RTKs引起磷脂酶（phospholipase,PL）活化,后者水解磷脂酰肌醇4,5二磷酸（phosphatidylinositol diphosphate,PIP2）,生成三磷酸肌醇（IP3）和DG.IP3通过胞内钙离子的动员而启动钙离子信号系统。DG在钙离子和磷脂酰丝氨酸的存在下可以激活PKC,从而磷酸化许多蛋白质和酶。过氧化氢和过钒酸钠能够诱导PLCγ发生磷酸化以及IP3 的产生。另外,过氧化氢还参与了EGF诱导的PLCγ的酪氨酸磷酸化过程［15］。

    氧化剂在大多数细胞中可以激活PLA2和PLD。尽管过氧化氢激活PLA2的机制仍然不清楚,但是有报道PLA2的激活需要PKC、小G蛋白Rac［16］的介导。另外,PTK和Ca2+可能参与了氧化剂诱导PLD激活的过程［17］。

    3.4  钙离子

    IP3通过作用于内质网上特异的受体或Ca2+通道,使其内部Ca2+释放,引起胞内Ca2+水平增加,从而启动胞内Ca2+信号系统,通过Ca2+钙调素依赖的蛋白激酶II（calmodulindependent protein kinase II,CaMK II）活性变化来调节和控制一系列生物学效应。另外,细胞内Ca2+发生动员后,引起细胞外的钙离子发生内移。

    氧化应激能够引起细胞内IP3的增多,细胞外钙离子内移和细胞内钙离子存储结构的释放,导致胞内钙离子的浓度增高。氧化剂诱导的钙离子动员可以被一种PTK的抑制剂——除莠霉素（herbimycin）所阻断,而且,在丧失Syk或Lyn的表达能力的突变细胞,氧化剂的钙离子动员作用发生部分抑制［18］。这提示氧化剂通过激活上游的PTKs引起IP3受体活化。

    IP3受体本身也受到氧化还原作用的调控。Berridge和他的合作者发现,GSSG能够促进肝细胞内一种IP3敏感钙离子池释放钙离子。接着,人们发现叔丁基过氧化氢能够在没有IP3刺激的情况下诱导钙离子的动员。采用纯化蛋白质研究发现,一种巯基氧化剂硫柳汞（thimerosal）能够直接促进IP3受体对IP3的亲和力,而GSSG可能通过一种的间接的方式促进IP3的结合［19］。因此,氧化还原作用对IP3受体的调控是多样化的。

    除了上述IP3受体以外,许多钙离子通道、钙离子ATP酶以及钙钠离子交换器同样也受到氧化还原作用的调控［20］。可见氧化还原作用对细胞内钙离子水平的调控方式也是多样化的。

    4  小结

    氧化还原状态在细胞调控中的重要性已被人们所认识,然而,氧化还原作用对细胞功能的调控机制还有许多地方未能阐明,其中主要的原因在于缺乏有效的实验手段。比如,对于细胞内蛋白质中半胱氨酸残基来说,其巯基随时可能在实验分析过程中发生氧化,而目前缺乏能够在细胞内有效识别其氧化或还原态的标记物。因而,要在分子水平上认识细胞内蛋白的氧化还原调控机制较为困难。但是,随着多种实验手段和方式的结合,人们在此领域仍在取得不断进步,而且,随着多学科交叉融合的进展,相信取得突破已为时不远。

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