临床常见腹泻致病菌的快速鉴定方法研究进展

【摘要】  腹泻是一种高发病率的胃肠道传染病,常见的腹泻致病菌有很多种,不同的致病菌对抗生素的敏感性不同,因此快速、准确的诊断和鉴定临床常见腹泻致病菌尤为重要。分子生物学和蛋白质组学技术具有快速、准确、敏感性高的优点,有着较好的临床应用前景。

【关键词】  腹泻致病菌;鉴定方法;分子生物学方法;蛋白质组学技术

　【Abstract】 Diarrhea is a kind of gastrointestinal diseases with high morbidity. There are many kinds of common diarrhea pathogenic bacteria,and different pathogenic bacteria have different sensitivity towards antibiotic,so it is particularly important to diagnose and identify common diarrhea pathogenic bacteria quickly and precisely. For its advantages of rapidity,precision and high sensitivity,the molecular biology and proteomic technology has a better application prospect. This essay will give a summary which focus on the application of molecular biology and proteomic technology in rapid test of common diarrhea pathogenic bacteria.

　　【Key words】 pathogenic bacteria of diarrhea; identification method; molecular biology; proteomics technology

　　腹泻是一种发病率高并流行于世界各地的胃肠道传染病,其发病率仅次于上呼吸道感染[1],在我国,感染性腹泻发病率居所有传染病首位[2]。目前细菌性腹泻的初步诊断主要是根据患者的临床表现结合流行病学依据和医生的经验,在诊断明确之前使用广谱抗生素,易导致细菌耐药。因此致病菌快速鉴定在疾病的诊断、临床用药、疾病控制等方面都有非常重要的意义。临床常规鉴定主要根据细菌的形态、染色性、理化性质进行鉴定,操作繁琐、耗时、灵敏性及特异性差。新兴的分子生物学和蛋白组学技术为快速准确鉴定临床常见腹泻致病菌提供了保证。本文就分子生物学和蛋白组学技术在临床常见腹泻致病菌检测和鉴定中的应用进行扼要综述。

　　1 常见腹泻致病菌常规分子生物学检测方法

　　1.1 常规

　　PCR技术是一种特异性扩增DNA的体外酶促反应,用于扩增位于两段已知序列之间的DNA,利用特异DNA序列鉴定细菌的方法，因其操作安全、简便快速、灵敏度高、特异性强等优点受到广泛重视。李小丽等[3]采用常规PCR方法从48例腹泻患者粪便中扩增痢疾杆菌侵袭质粒基因(ipah)和侵袭相关基因位点(ial)基因,其基因阳性率分别为100%(48/48)、70.8%(34/48),电泳结果显示扩增到的ipaH和ial 基因特异片段与基因库中标准菌株序列一致性为100%,从而建立了一种快速、特异、敏感的分子生物学诊断方法对腹泻患者粪便中的痢疾杆菌致病基因ipaH及ial 进行检测。

　　1.2 多重PCR(multiplex PCR)

　　多重PCR是在同一个反应管中用多对引物同时扩增几条DNA片段的方法,其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。多重PCR在腹泻致病菌的诊断上已得到较好应用,可以同时检测一种致病菌的多个基因,也可以同时检测多种致病菌[47]。Belanger等[8]运用荧光定量多重PCR,通过检测艰难梭菌的毒素基因tcdA和tcdB可快速鉴定粪便样本中艰难梭菌。赵明光等[9]通过建立多重PCR反应体系,用一次PCR即可检测致病性大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、空肠弯曲菌这四种儿童常见肠道致病菌,灵敏度达10～100 cfu/ml.2005年Phantouamath等[10]建立多重PCR法检测志贺菌属的ipaH和ial致病基因,以诊断细菌性痢疾。Thong等[11]针对志贺菌的set1A、set1B、ial、ipaH基因,设计不同的引物对,在同一PCR反应体系内同时扩增set1A、set1B、ial、ipaH基因,对84株福氏志贺菌、15株宋氏志贺菌、10株痢疾杆菌、1株鲍特氏菌进行检测,结果显示重现性为100%,最低检测浓度为100 cfu/ml,并且不出现假阳性和假阴性。与其他常规方法相比,多重PCR省时、省力、灵敏性更高,在做更多基因靶点时优势更突出。

　　1.3 巢式PCR(nested PCR)

　　是指利用两套 PCR 引物(巢式引物)进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中,外引物以产生扩增产物,该产物在内引物存在下进行第二轮扩增。由于此反应有两次PCR扩增,降低了扩增多个靶位点的可能性,增加了检测的敏感性;加上两对引物与检测模板的配对,增加了检测的可靠性。大肠弯曲杆菌及空肠弯曲杆菌在样品中含量少,用常规的检测方法不易检测,Bang等[12]以16S rRNA设计两对引物,先进行通用引物PCR,扩增产物1495 bp,以第二对引物进行巢式PCR,扩增产物833 bp.此外,以马尿酸酶基因设计4条引物,先以其中2条进行PCR,扩增产物长度为1028 bp,再同时加入4条引物进行巢式PCR,扩增产物分别为383 bp,645 bp.利用该技术,检出敏感性达2～3 cfu/ml,检测时间由2～4周减少到1天。

　　1.4 实时荧光PCR技术(real  time fluorescence PCR)

　　该技术在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法,其不仅具有普通PCR的高灵敏性,而且由于应用了荧光探针,可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果,所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性。2009年,徐德顺等[13]利用特异性的TaqMan荧光定量PCR技术,以大肠杆菌O157H7的rfbE基因作为靶序列,设计一对引物和探针,以大肠杆菌O157H7菌株提取核酸DNA作为模板,建立的反应体系在引物和探针的浓度为0.6 μmoL/L、0.8 μmoL/L,Mg2+浓度为4 mmoL/L时,具有良好的特异性和敏感性,在鸭沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌EIEC、副溶血性弧菌、奇异变形杆菌、单增李斯特菌、福氏志贺氏菌等10菌株的检测中,除大肠杆菌O157H7出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性,在纯菌条件下,定量检测低限17 cfu/ml。稳定性分析表明同一样品重复检测3次Ct值的变异系数均小于5%,本方法从核酸提取至完成检测最快能在3小时内完成,敏感度可达10 cfu/ ml,而且该方法实行完全闭管式操作,避免了常规PCR扩增产物污染和假阳性的问题。

　　2 蛋白质组学技术

　　蛋白质组学技术近年来在很多方面得到了广泛的应用,在细菌鉴定方面的研究也已起步。细菌种类繁多,其蛋白质是细菌功能的执行者,不同蛋白种类决定细菌千变万化的功能和特征。

　　2.1 双向电泳技术(Twodimensional gel electrophoresis)

　　双向电泳是一项基于蛋白的电荷和分子量来分离蛋白的技术。首先基于蛋白的固有电荷,通过等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)进行第一向蛋白分离,然后根据蛋白的分子量,在第二向中通过SDSPAGE电泳进行蛋白分离。双向电泳技术已经成为医学检验中常用的技术。夏金兰等[14]优化了大肠杆菌外膜蛋白双向电泳技术体系,通过实验发现样品裂解液中包含低浓度的tris是外膜蛋白双向电泳成功的关键因素,Chaps与ASB14或NP40结合使用可显著提高外膜蛋白的溶解能力,缩短聚焦时间,建立了其双向电泳图谱。Liao等[15]曾对志贺菌标准株作过全菌蛋白质双向电泳,共得到488的个蛋白质点,Ying[16]及Jennison[17]等也分别对其外膜蛋白进行双向电泳,得到了外膜蛋白的电泳图谱,利于今后细菌致病性、抗菌药物及疫苗的研究。

　　2.2 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDITOFMS)

　　MALDITOFMS是将生物大分子与一特定的基质分子混合,用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜,基质从激光中吸收能量传递给生物分子,软电离出一个电子。利用这种技术可以得到分子的母体离子和一些大的碎片离子,对于几十万甚至几百万质量数的分子可以进行检测,而且时间飞行质谱仪的分析时间快,原则上它可以在一次电离事件中给出所有离子的质谱图。研究表明,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱可检测细菌蛋白表达,并可根据蛋白表达对细菌进行快速鉴定[18,19]。1996年,Claydon等[20]采用MALDITOFMS成功鉴定了G-和G+细菌,表明不同种属的细菌具有不同的蛋白指纹图谱,同一种细菌具有相似的蛋白指纹图谱,根据细菌蛋白指纹图谱可对细菌进行快速鉴定。王晔茹等[21]利用优化的MALDITOFMS实验条件对从门诊腹泻患者粪便分离的88株沙门菌进行了检测和分型,并与血清学分型、耐药分型和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型进行比较,结果在反映亲缘关系的差异水平值为100时,88株沙门菌被分为15个MALDITOFMS型别。MALDITOFMS分型结合耐药表型分型,可以将88株沙门菌分成44个亚型。MALDITOFMS分型结合血清学分型,可以将88株菌分成46个亚型。MALDITOFMS分型结合PFGE分型,可以将88株菌分成64个亚型,说明MALDITOFMS在沙门菌分型中具有很好的分型能力。

　　2.3 表面加强激光解析电离飞行时间质谱(SELDITOFMS)

　　SELDITOFMS由2002年诺贝尔化学奖得主田中发明,蛋白芯片表面经过化学或生物化学处理,特异地与被测标本的蛋白结合,通过选择性洗涤,获得高分辨率的保留蛋白谱。当加入能量分子后,芯片上保留的蛋白形成晶体,在激光照射下,晶体解离,带电分子在通过电场时加速,检测仪记录飞行时间的长短。质荷比越小,飞行时间越短,就会被最先检测到。检测信号转换后,被测蛋白质以一系列峰值的形式呈现,即蛋白指纹图谱。该技术具有样本用量小,敏感性高(<1 fmol),检测蛋白质分子量范围大(0～500 kD),检测速度快,可重复性较好等优点,是目前蛋白组学研究较先进的技术。国内外一些相关试验表明SELDITOFMS在细菌鉴定方面有很高应用价值。肖代雯等[22]利用SELDITOFMS建立了E.coli的特征性蛋白指纹图谱,为快速诊断大肠埃希菌感染提供了新的思路。

　　3 结语

　　综上所述,准确、简便、快速鉴定常见腹泻致病菌无论对临床诊断和治疗,还是对实验研究都有重要意义。传统方法不仅耗时,而且敏感性和特异性低。新兴的分子生物学技术尤其蛋白质组学技术在临床常见腹泻致病菌检测和鉴定中具有操作简便、省时省力、敏感性高、特异性好、准确、可靠等优点,在腹泻致病菌鉴定中有着巨大的潜力和广阔的应用前景。目前分子生物学方法尤其蛋白质组学技术在临床常见腹泻致病菌中的应用处于研究阶段,在方法学和临床实验室的具体应用中还需要进一步深入研究。

【参考文献】
  　　[1] 聂青和.感染性腹泻的研究现状[J].传染病信息,2007,20(4):193196.

　　[2] 吕福礼.感染性腹泻的病原菌检测分析[J].中国现代药物应用,2009,12(3):6162.

　　[3] 温艳,阴赪宏,黄敏君，等.PCR快速检测腹泻患者粪中痢疾杆菌致病基因ipaH 和ial [J].世界华人消化杂志,2007,15(19):21282132.

　　[4] Karami A,Ahmadi Z,Safiri Z,et al.Development of an ultra rapid and simple multiplex polymerase chain reaction technique for detection of Salmonella typhi[J].Saudi Med J,2006,27(8):11341138.

　　[5] 王静,杨瑞馥,郭兆彪,等.多重PCR快速检测食品中肠出血性大肠杆菌[J].卫生研究,2001,30(5):310312.

　　[6] 许一平,成炜,邵彦春,等.沙门菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测[J].微生物学通报,2006,33(6):8994.

　　[7] 蒋鲁岩,陈光哲,段宏安,等.应用PCR技术同步检测动物产品中的4种致病菌[J].检验检疫科学,2003,13(4):79.

　　[8] Bélanger SD,Boissinot M,Ménard C,et al.Rapid detection of shiga toxinproducing bacteria in feces by multiplex PCR with molecular beacons on the smart cycler [J].J Clin Microbiol,2002,40(4):14361440.

　　[9] 赵明光,万根平,黄勇,等.四种儿童常见肠道致病菌的多重PCR检 测[J].广东医学,2009,30(8):10691071.

　　[10] Phantouamath B,Sithivong N,Insisiengmay S,et al.Pathogenicity of shigella in healthy carriers:a study in Vientiane[J].Jpn J Infect Dis,2005,58:232234.

　　[11] Thong KL,Hoe SL,Puthucheary SD,et al.Detection of virulence genes in Malaysian Shigella species by multiplex PCR assay[J].BMC Infect Dis,2005,5(1):8.

　　[12] Bang DD,Wedderkopp A,Pedersen K.Rapid PCR using nested primers of the 16S rRNA and thehippuricase(hipO)genes to detect Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in environmental samples[J].Mol Cel Probes,2002,16:359369.

　　[13] 徐德顺,沈月华,程平庆.大肠杆菌O157:H7实时荧光PCR快速检测方法的建立[J].上海预防医学,2009,21(4):174177.

　　[14] 夏金兰,欧阳叙东,张成桂，等.大肠杆菌外膜蛋白的分离及其双向电泳图谱的建立[J].现代生物医学进展,2009,2(9):201204.

　　[15] Liao X,Ying T,Wang H,et al.A twodimensional proteome map of Shigella flexneri[J].Electrophoresis,2003,24:28642882.

　　[16] Ying TY,Wang JJ,Wang HL,et al.Immunoproteomics of membrane proteins of Shigella flexneri 2a 2457T[J].World J Gastroenterol,2005,11(43):68806883.

　　[17] Jennison AV,Raqib R,Verma NK.Immunoproteome analysis of soluble and membrane proteins of Shigella flexneri 2457T[J].World J Gastroenterol,2006,12:66836688.

　　[18] Bright JJ,Claydon MA,Soufian M,et al.Rapid typing of bacteria using matrixassisted laser desorption ionization timeofflight mass spectrometry and pattern recognition software[J].J Microbiol Methods,2002,48:127138.

　　[19] Liu H,Du Z,Wang J,et al.Universal sample preparation method for characterization of bacteria by matrixassisted laser desorption Ionization time of flight mass spectrometry [J].Appl Environ Microbiol,2007,73:18991907.

　　[20] Claydon MA,Davey SN,Edwards Jones V,et al.The rapid identification of intact microorganisms using mass spectrometry[J].Nat Biotechnol,1996,14(11):15841586.

　　[21] 王晔茹,崔生辉,李凤琴.基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱在沙门菌检测和鉴定分型中的应用研究[J].卫生研究,2008,37(6):685689.

　　[22] 肖代雯,杨永长,喻华,等.大肠埃希菌蛋白指纹图谱的建立[J].中国微生态学杂志,2008,20(5):472474.