生化汤谱效关系初探

【摘要】  目的 研究生化汤不同配伍组方的药效与其化学成分指纹图谱间的关系,阐述生化汤配伍机理。方法 按照君臣佐使中医组方原理,采用撤药分析法对生化汤进行拆方研究,观察比较各配伍组方对急性血瘀大鼠血液流变学和血浆血栓素B2(TXB2)、前列环素F1α(PGF1α)的药效作用的不同,并从整体上考察各配伍组方化学成分指纹图谱间的差异。结果 缺桃仁组方对急性血瘀大鼠的全血黏度、血浆黏度、TXB2水平和TXB2/PGF1α的值的影响与生化汤全方比较均有显著性差异(P<0.05或P<0.01);缺川芎组方对红细胞聚集指数、红细胞压积、红细胞电泳指数、血沉方程K值的影响与全方比较亦有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。结论 生化汤全方对急性血瘀大鼠的治疗作用优于其他缺药组方,而上述13种物质均有可能是生化汤药效物质基础的重要组成部分。

【关键词】  生化汤;撤药分析;谱效关系;物质基础

　【Abstract】 Objective To explore the relationship between shenghua decoction's pharmacological effects and HPLC fingerprint within five different compositions and to clarify the compatibility principles of the prescription. Methods Following the traditional Chinese medical (TCM) theory of principal,assistant,complement and mediating guide and dismantling drugs to determine the compatibility regularity of medicinal materials,the effects of different shenghua decoction compositions on hemorheology,thromboxane B2(TXB2),and prostaglandin F1α(PGF1α) in acute blood stasis model of rats were observed; meanwhile,the fingerprint spectrum changes between the compositions were investigated as a whole. Results Two prescriptions without Prunus persica,compared with original shenghua decoction,had significant effect on plasma viscosity,blood viscosity,contents of TXB2 and TXB2/PGF1α (P<0.05 or P<0.01); the prescription without Ligusticum chuanxiong,compared with original shenghua decoction,significantly increased volume of packed red blood cell,blood cell aggregation index,erythrocyte electrophoretic index,and K value of blood sedimentation equation (P<0.05 or P<0.01).Conclusion The original shenghua decoction has better therapeutic effect on acute blood stasis model of rats than other compatibility groups missing herbs.The 13 components mentioned may be the indispensable parts of material basis of TCM preparation of shenghua decoction.

　　【Key words】 shenghua decoction;drugdismantling analysis;chromatogrampharmacodynamics relationship;material basis

　　生化汤来源于南宋末年的《女科秘要》,由当归、川芎、桃仁、炮姜和炙甘草组成,是妇科临床经典用药[1]。生化汤方中重用当归补血活血,祛瘀生新为君;川芎活血行气、祛风止痛,桃仁活血祛瘀,共为臣药;炮姜走血分,温中散寒,为佐药;炙甘草调和诸药,为使药。全方配伍,共奏化瘀生新,温经止痛之功。

　　近年来，中药复方配伍的研究已有较大的发展,比较经典的方法是通过配伍变化产生药效学的差异来研究配伍机理[2];或者通过一种或几种指标性成分的变化,考察不同药物对全方的贡献[3];也有运用现代高新技术手段如中药指纹图谱技术对复方所含化学成分进行整体描述,通过比较配伍变化产生指纹图谱的差异来解释配伍规律[4]。中药复方“谱效关系”研究正是建立于上述研究方法的基础之上将反映复方活性成分群特征峰的指纹图谱与药效结果对应起来,将配伍过程中化学成分的变化与中药药效的变化联系起来[5],探讨配伍规律。在生化汤研究中,尚未见报道采用谱效关系的方法进行配伍规律的研究,因此本实验根据中医君臣佐使的组方原理,采用撤药分析法研究不同配伍组方药理作用的变化和HPLC色谱图上指纹的变化,并将药理作用与化学成分谱相联系,从谱效关系角度初步阐明生化汤的药效物质基础及配伍原理。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 动物

　　SD系大鼠,体重(200±20)g,6周龄,雌性,徐州医学院动物中心提供,生产许可证号:SYXK(苏)2007-0037.

　　1.1.2 仪器

　　FASCO 302型全自动血液流变快测仪,重庆大学维多生物工程研究所生产。Shimadzu LC10ADvp高效液相色谱仪(日本岛津公司),包括SCL10Avp 系统控制器;SPDM20A DAD二极管阵列检测器;FCV10ALvp四元低压梯度混合器;SIL20A自动进样器;LCSolution 1.22 SP1色谱数据工作站。MilliQ50超纯水仪,美国Millipore公司生产。H66MC型超声波清洗机,无锡超声电子设备有限公司生产。AE240型十万分之一电子天平,瑞士梅特勒托利多公司生产。γ放射免疫计数器,中国科学技术大学科技实业总公司生产。

　　1.1.3 试药与试剂

　　高分子右旋糖酐(50万U)为深圳汉邦多糖生物科技有限公司产品,批号为HD09004,临用前用生理盐水配成10%浓度。当归、川芎、桃仁、甘草及炮姜等药材由徐州医药股份有限公司中药饮片厂提供,经本校中药教研室王健慧副教授鉴定,当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根;川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎;桃仁为蔷薇科植物桃Prunus persica(L.)Batsch的干燥成熟种子;炮姜为姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根茎的炮制加工品;炙甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根茎的炮制加工品。标准品阿魏酸,批号为06081427;标准品甘草苷,批号为06121824;标准品甘草酸,批号为06110101,均由上海同田生物科技有限公司提供。血栓素B2(TXB2)放射免疫分析药盒,批号为RV50909;6酮前列腺素F1α(6KetoPGF1α)放射免疫分析药盒,批号为RV60909,均购自天津九鼎医学生物工程有限公司。甲醇(色谱纯),美国J.T.BAKER公司提供。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 生化汤各配伍组方的制备

　　按表1配比及文献[6]的方法制备生化汤各配伍组方水煎液,样品编号为S1～S5,均浓缩至43 ml(相当每毫升含0.56 g当归、0.21 g川芎、0.14 g桃仁、0.047 g炮姜、0.047 g炙甘草),4℃冰箱冷藏备用。同法制备各单味药材对照液。

　　1.2.2 生化汤各配伍组方药效学指标的测定

　　取大鼠56只,随机分为7组,即正常对照组(NS)、模型组(MG)、S1～S5组。适应性饲养2天后,S1～S5组大鼠按20 ml/kg灌服相应的生化汤配伍组方;正常对照组及模型组每日灌服同等容积蒸馏水,每日2次,连续7天。于末次给药40 min后,除NS组外其余各组参照文献[7]方法同时造模(由尾静脉注射10%高分子右旋糖酐10 ml/kg,正常对照组注射同等剂量的生理盐水)。20 min后,在10%水合氯醛麻醉下(3.5 ml/kg,ip),腹主动脉采血6 ml,其中4 ml血液用1%肝素抗凝(150 μl 肝素:4 ml 血液),2 h内迅速对血液流变学指标进行测定;2 ml血液用50 μl消炎痛EDTA.Na2抗凝,4℃,3000 r/min离心10 min,分离血浆,-20℃保存,临用前用生理盐水稀释10倍测TXB2,稀释5倍测6KetoPGF1α.

　　1.2.3 生化汤各配伍组方指纹图谱的建立

　　色谱柱:KromasilC18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱温:30℃.表1 样品溶液的制备

　　1.3 统计学方法

　　采用SPSS13.0统计软件进行数据处理,实验结果以±s表示,计量资料的多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),两两比较采用q’检验,P<0.05认为差异有显著性。

　　2 结果

　　2.1 生化汤各配伍组方间药效学比较

　　2.1.1 生化汤配伍组方对急性血瘀证大鼠血浆粘度和全血黏度的影响

　　由表2中结果可以看出,与正常对照组比较,模型组大鼠血浆黏度和全血黏度显著升高(P<0.01)。与S1组相比,S2、 S3组大鼠的血浆黏度和全血黏度无显著性差异(P>0.05);S4、S5组大鼠的血浆黏度和全血黏度比S1组明显升高(P<0.05或P<0.01)。

　　2.1.2 生化汤配伍组方对急性血瘀证大鼠红细胞聚集指数、红细胞压积、血沉方程K值及红细胞电泳指数的影响。

　　由表3中结果可以看出,模型组大鼠红细胞聚集指数、红细胞压积、红细胞电泳指数及血沉方程K值与正常对照组相比均有显著性提高(P<0.01)。S2、S3、S4组大鼠的上述各指标与S1组相比无显著性差异(P>0.05);S5组大鼠的各指标与S1组相比差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

　　由表4中结果可以看出,模型组大鼠血浆中TXB2、TXB2/6KetoPGFα与模型组较正常对照组比较均有显著性提高(P<0.01)。与模型组相比,服用各配伍组方后,S1～S5组大鼠的上述两个指标均显著下降(P<0.05或P<0.01)。与S1组比较,S4、S5组大鼠的上述两个指标显著升高(P<0.05或P<0.01)。

　　2.2 HPLC指纹图谱分析

　　2.2.1 指纹图谱检测波长的选择

　　采用二极管阵列检测器对“1.2.3项”下制得的生化汤全方供试品溶液进行210～400 nm范围内全波长扫描,并提取其中254 nm、270 nm、320 nm、360 nm 4个检测波长的色谱图对全成分进行考察,结果发现270 nm处成分最多,峰形较好,基线较稳定(见图1),因此选择以270 nm为检测波长。

　　2.2.2 指纹图谱中各峰归属的确认

　　经过对单味药材提取液的色谱图比较(见图2),发现在2～9 min处所出峰为各药材中一些极性较大的成分,在非极性色谱柱中不保留,分离度很差,且在各单味药材提取液中均有出现,无法确认属于哪个单味药材,因此不将其列入比较分析。从生化汤全方的色谱图中共分辨出30个峰,经确认,当归拥有30号峰;川芎拥有3、10、12、21、22、27、28号峰;炮姜拥有15号峰;炙甘草拥有17、18、25、26、29号峰;当归和川芎共有2、4、5、8、9、14、19、20、23、24号峰。由于方中药味较多,因此存在一些相似或相同的成分,在该色谱条件下,一个色谱峰往往是多味中药的共同体现。1、11号峰为当归、川芎和炙甘草共有;16号峰为当归、川芎和桃仁共有;7号峰为当归、炮姜和炙甘草共有;6号峰为当归、川芎、桃仁共有。与标准品比对,14号峰为阿魏酸,17号峰为甘草苷,29号峰为甘草酸(见图3)。

　　2.2.3 生化汤配伍组间指纹图谱的比较 由图4中的指纹图谱直观比较来看,S4组和S1组指纹图谱的差别主要在于缺失了15、17、18、25、26、29号峰,这些峰源自于炙甘草,此外6号峰的峰面积有一定减小(数据未提供)。S5组与S1组指纹图谱比较除了缺失上述6个峰外,还缺失了3、10、12、21、22、27、28号峰,而且6、8、9、11、14、16、23号峰的峰面积也有较大差异(峰面积数据均未提供)。　表2 生化汤各配伍组方对急性血瘀证大鼠血浆黏度和全血黏度的影响表3 生化汤各配伍组方对急性血淤证大鼠红细胞聚集指数、红细胞压积、血沉方程K值及红细胞电泳指数的影响表4 生化汤及其配伍组方对急性血淤证大鼠血浆中TXB2、6KetoPGF1α及TXB2/6KetoPGF1α的影响图1 不同检测波长下生化汤全方的指纹图谱　图2 各单味药水煎液指纹图谱图3 混合标准品(A)和生化汤全方的指纹图谱(B)　(1:阿魏酸;2:甘草苷;3:甘草酸)图4 生化汤各配伍组方间指纹图谱的比较(270 nm)

　　3 讨论

　　药效实验结果表明,生化汤全方对高分子右旋糖酐引起血液的浓、黏、凝、聚状态均有显著的改善作用,这种作用优于其它缺药组方。缺桃仁组方与生化汤全方对急性血瘀大鼠血液流变学指标中与血液黏度有关的血浆黏度、全血黏度,及与血栓形成有关的TXB2水平和TXB2/6KetoPGF1α值的影响有显著性差异(P<0.05或P<0.01);缺少川芎组方与生化汤全方对急性血瘀大鼠血液流变学指标中与红细胞有关的红细胞聚集指数、红细胞压积、红细胞电泳指数、血沉方程K值的影响有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。上述差异的产生可能与桃仁有较强的抗血小板聚集的作用[8]和川芎有活血行气的功效[9]有关。臣药川芎与桃仁的加入会显著加强君药当归活血化瘀的功效,初步证明了生化汤组方原理的科学性和合理性。

　　通过对生化汤HPLC指纹图谱的研究,可以发现生化汤中的大部分成分来自于当归和川芎。两者共有成分比较多,在方中用量较大,两者合煎时,其物质具有加和性[10],因此构成了生化汤指纹图谱的主体部分。炙甘草虽然用量较小,但因其含水溶性成分如三萜类化合物、黄酮类化合物、有机酸类等[11]较多,含量比较大,在考察的波长下有较强的紫外吸收,因此在本实验条件下对生化汤的指纹图谱指纹性的贡献较大。桃仁中所含主要成分为脂质、苷类(苦杏仁苷、野樱苷)等[12],炮姜所含成分主要为挥发油类、烷基酚类等[13],这些成分大部分为无紫外吸收或紫外吸收较弱的成分,因而在本实验条件下对生化汤指纹图谱的指纹性贡献较小。

　　将药效作用差异比较明显的缺桃仁组方与全方的指纹图谱比较来看,缺失的成分主要来自炙甘草;当归组方和全方指纹图谱的比较可以发现,缺失的成分主要来自于川芎和炙甘草,这说明了使药炙甘草、臣药川芎对增强君药当归生物学效应的重要性;同时配伍组间的一些共有成分在煎煮过程中因为发生了物质之间相互助溶、促溶及阻溶等复杂的物理和化学变化,使得这些成分的溶出率不同,造成了缺药组方的药效与全方药效的差异。总之这些变化后的成分才是复方起作用的成分,才是复方具有独特作用的物质基础。因而可以初步推测生化汤活血化瘀的药效是缺失的化学成分与复方中其它成分协同作用的效果。

　　中药复方药效物质基础和配伍机理研究是中药复方走向现代化的关键性问题,然而中药复方药味组成多,化学成分复杂,研究和表征药理活性物质基础有很大的难度。本实验根据中医“君臣佐使”的组方理论对复方生化汤进行拆方研究,在明确了全方药效好于其它配伍组方的基础上,探究不同配伍组方与全方之间药理效应的差异,并结合配伍过程中化学指纹图谱的变化,从“谱效关系”角度初步阐明复方的药效物质基础和配伍机理,为中药复方及其它研究提供了一条新的思路。然而受认知水平及分析手段所限,本实验无法对一些反映复方药理活性的特征峰进行定性及定量研究。因此应在下一步研究中,综合利用LC/MS/MS,制备液相,液相核磁共振波谱联用技术对其进行分析,从而更加深入地阐明复方生化汤的药效物质基础及其配伍机理。

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