重组人Importin α的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

【摘要】  目的 重组表达人细胞核输入蛋白α(Importin α),制备多克隆抗体。方法 提取人肝癌细胞HepG2中的总RNA,RTPCR法扩增Importin α 基因。构建pGEX6P1Importin α 融合表达载体,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基硫代βD半乳糖苷(IPTG)诱导表达GSTImportin α 重组蛋白,经谷胱甘肽亲和层析纯化,然后免疫小鼠,制备多克隆抗体,ELISA 检测抗体效价。结果 RTPCR扩增出的Importin α 基因片段(1300bp)与理论大小一致。SDSPAGE和蛋白质印迹分析纯化GSTImportin α 重组蛋白相对分子质量为83kD,与质谱分析的相对分子质量结果相符。重组蛋白免疫小鼠后收获抗血清,ELISA显示抗体效价高。结论 在大肠埃希菌中成功表达并纯化Importin α 蛋白,获得多克隆抗体,为进一步研究输入系统及其应用打下基础。

【关键词】  核输入蛋白α;原核表达;蛋白质纯化;抗体制备

　Abstract:Objective To express recombinant Importin α and prepare antiImportin α polyclonal antibody.Methods The Importin α gene was obtained by RTPCR from the total RNA of human hepatoma cell HepG2 and cloned into the vetor pGEX6P1.The recombinant plasmid pGEX6P1Importin α was transferred into E.coli BL21 and the GSTImportin α fusion protein was expressed by inducing with IPTG.The fusion protein was purified by glutathione sepharose 4B affinity chromatography.Mice were immunized with recombinant Importin α,and the titer of the polyclonal antiserum was detected by ELISA.Results The length of the RTPCR product of Importin α was consistent with the expected.The purified GSTImportin α fusion protein was 83kD demonstrated by SDSPAGE,mass spectrometry and western blot.Antiserum was obtained by immunizing in mice and had a high titer determined by ELISA.Conclusion The recombinant Importin α is prokaryotically expressed and purified,and polyclonal antibody is obtained.Our study lays the foundation for further research of importing system and its application.

　　Key words:Importin α;prokaryotic expression;protein purification;antibody preparation

　　核膜上分布的核孔复合体(NPC)是沟通细胞核内外物质交流和信息交流的主要通道。生物大分子经NPC跨核膜转运是真核细胞基因复制、转录和翻译的必要环节,也是联系细胞内信号转递、参与细胞核反应(即细胞增殖、分化、凋亡等核反应)调控的重要环节。Importin蛋白是核定位信号的受体蛋白,存在于胞质溶胶中,可与核定位信号结合,帮助核蛋白进入细胞核,这种受体称为输入蛋白。它们作为一种穿梭受体( shuttling receptor )在细胞质内与核蛋白的核定位信号结合,然后一起穿过核,在核内与亲核蛋白分离后再返回到细胞质中。输入蛋白有α和β两种亚基。本实验主要研究Importin α,在克隆全长人Importin α cDNA的基础上,构建了重组人Importin α 的原核表达载体,在大肠埃希菌中进行表达、纯化,并获得小鼠抗人Importin α多克隆抗体,为进一步深入研究其生物活性及其应用打下基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 质粒、菌株与细胞系

　　E.coli DH5α菌株和E.coli BL21菌株为本实验室保存;HepG2细胞来自四川大学国家重点实验室。

　　1.1.2 试剂与仪器

　　异丙基硫代βD半乳糖苷(IPTG),蛋白预染Marker.PCR仪,紫外分光光度计,高速冷冻离心机(Eppendorf公司);MiniProtein Ⅳ电泳系统(BioRad公司);凝胶成像系统(Gene公司)。

　　1.1.3 引物

　　根据人Importin α基因序列设计引物,5’端引物包含起始密码子并引入BamH I酶切位点,3’端引物包含终止密码子并引入Xho I酶切位点(下划线为酶切位点),引物序列如下:上游引物序列为:5’GTG GAT CCA TGTCCACCAACGAGAATGCT3’;下游引物序列为:5’CGC TCG AGC TAAAAGTTAAAGGTCCCAGG3’.

　　1.2 方法

　　1.2.1 重组表达质粒pGEX6P1Importin α的构建

　　用TRIzol法提取HepG2细胞总RNA,根据逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后,按照回收试剂盒说明书纯化回收目的片段。将Importin α基因纯化回收产物与载体pGEX6P1分别用BamH I和Xho I限制性内切酶进行双酶切,分别用1%与1.5%琼脂糖凝胶电泳后,切胶回收线性载体与目的基因片段。将Importin α目的基因与pGEX6P1线性载体2∶1用T4连接酶22℃连接1h后,连接产物转化到大肠埃希菌感受态细胞E coli DH5α中。将连接产物用BamH I和Xho I酶进行双酶切,酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测[1]。

　　1.2.2 重组质粒载体的诱导表达

　　将构建好的重组质粒pGEX6P1Importin α转化到宿主菌BL21中进行诱导表达。在LB琼脂培养基(Amp)上挑取菌落并接种到5ml LB(Amp)液体培养基中,37℃振荡培养14 h.次日将培养菌接种到50ml LB(Amp)液体培养基中,37℃振荡培养3h,使其A540为0.40.6,加入IPTG,使其终浓度达到0.2 mmol/L,继续在28℃振荡培养5h,诱导Importin α 重组蛋白表达[1]。

　　1.2.3 Importin α 重组蛋白的纯化

　　将制备的抗血清稀释5倍,上样至 Protein A亲和层析柱(按说明书操作)进行纯化,用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱,收集的抗体溶液立即中和并透析,70℃保存备用[2]。

　　1.2.4 Importin α 重组蛋白的鉴定

　　取纯化样品,经12% SDSPAGE分离后,用考马斯亮蓝染色,进行质谱分析。采用蛋白质印迹方法。将上述纯化蛋白行12% SDSPAGE后,半干法转印至硝酸纤维素膜上,5%脱脂牛奶适当摇晃后放入4℃,牛奶倒入TBST(150 mmol/L NaCl、0.1%Tween20、20mmol/L TrisHCl,pH 7.27.4)漂洗3次(5min/次),加入兔抗人多克隆抗体(1∶1000)封闭4℃ 过夜。取出用TBST漂洗3次,加入羊抗兔多克隆抗体,封闭2h后,再用TBST漂洗3次(5min/次),再用TBS漂洗一次(5 min),ECL_plus 显色液显色,Typhoon 多功能激光扫描成像系统扫描[3]。

　　1.2.5 多克隆抗体的制备

　　将纯化Importin α 蛋白采用腹腔注射方式免疫ICR小鼠制备多克隆抗体。每只小鼠每次注射剂量为100 μg Importin α,每7天免疫一次,共四次。首次免疫时,取纯化Importin α 蛋白适量,加等体积福氏完全佐剂,乳化后于多点注射于实验小鼠背部皮下,每点约20μl,每只小鼠约注入100μg(约100μg混合液 )目的蛋白。最后一次免疫3天后摘除眼球取血,分离血清,-20 ℃保存[4]。

　　1.2.6 多克隆抗体的效价测定

　　抗Importin α效价检测采用间接ELISA,将纯化的重组蛋白稀释为1.0μg/ml作为包被抗原,鼠抗血清倍比稀释作为一抗,免疫前鼠血清作为阴性对照,兔抗鼠IgGHRP为二抗,加入显色液,终止反应。BioRad 450全自动酶标仪测定各孔在450 nm的光密度值,以P/N>2.1且PN>0.2所对应的最大抗体稀释倍数为抗体效价[5]。

　　2 结果

　　2.1 RTPCR

　　用TRIzol法提取HepG2细胞总RNA后,逆转录获得cDNA,通过PCR 扩增获得目的基因片段。PCR产物经1.0% 琼脂糖凝胶电泳分析,结果显示importinα基因片段为1590 bp,与理论 DNA 表达片段大小一致(图1),以此PCR产物进行BamH I和Xho I酶双酶切。图1 Importin α RTPCR片段的琼脂糖电泳

　　2.2 重组表达载体的构建

　　将扩增得到的importinα基因片段与pGEX6P1质粒连接后转化E.coli DH5α,获得pGEX6P1Importin α重组质粒,经1.0% 琼脂糖凝胶电泳分析,可见获得了单一纯质粒,以此为模板,进行PCR验证。

　　重组质粒经PCR验证,扩增片段大小为1600bp左右,与理论相符(图3),证明目的基因插入到了pGEX6P1质粒中。将此重组质粒测序,结果鉴定显示克隆的Importin α 基因序列与基因本身表达序列相符。

　　2.3 重组蛋白的诱导表达

　　将重组质粒pGEX6P1Importin α导入大肠杆菌BL21,筛选出转化子。重组蛋白诱导表达情况见图4.结果表明,与未加IPTG诱导的样品相比,随着IPTG诱导时间延长,83kD的重组蛋白GSTImportin α表达增加。图2 pGEX6P1Importin α重组质粒的琼脂糖电泳　图3 PCR鉴定pGEX6P1Importin α重组表达质粒

　　2.4 重组蛋白的质谱鉴定

　　纯化获得的GSTImportin α蛋白经12% SDSPAGE分离后,用考马斯亮蓝染色,切除83kD蛋白带,通过胶内酶解后,对酶解产物进行ESITOFMS质谱分析,结果通过http://www.matrixscience.com网站的MASCOT数据库查询,鉴定结果见图5.质谱鉴定结果表明,样品中主要蛋白GST和Importin α,数据库得分分别在400分和1200分以上,远高于及格分数线45分。质谱结果表明,83kD电泳蛋白条带为GSTImportin α重组蛋白。图4 GSTImportin α 重组蛋白的表达

　　2.5 Western blot

　　纯化GSTImportin α 重组蛋白经 12% SDSPAGE 分析后进行蛋白印迹鉴定,可见在相对分子质量约为83kD处出现特异性条带,表明为Importin α蛋白(图6)。图6 GSTImportin α免疫印迹

　　2.6 多克隆抗体的特异性分析及效价测定

　　Western blot 结果显示约在83kD处有特异性显色反应,无杂交带出现,表明制备的多克隆抗体能与表达蛋白集合,并具有较强的特异性。以纯化的融合蛋白Importin α为包被抗体,间接ELISA法测定多克隆抗体效价,结果表明抗体效价达到 1∶1×105(图7)。图7 鼠抗Importin α效价检测

　　3 讨论

　　在真核细胞中,NPC是一种具有分子筛功能的孔状结构,能允许分子量小于4060kD的小分子物质以自由扩散通过,而分子量超过此范围或直径大于6nm的生物大分子(如mRNA、蛋白质等)则必须在胞质中可溶性转运受体蛋白的介导下,以能量依赖的方式进行主动转运[8,9]。

　　大分子蛋白及部分小分子物质通过耗能的主动运输方式进行核转运,并通过核转运受体家族(importins)促进转运[10]。importinβ直接结合到货物蛋白及核孔蛋白上。在人类细胞中多于20种importinβ超家族成员已经被发现[11]。在经典核输入通路中,importinβ1通过核输入结合体家族中的importinα结合到货物蛋白上,并在人类细胞中发现了6种importinα.大多数importinα和importinβ对于不同类型的货物表现出不同的偏好性,表明不同的刺激可能补充不同的importins从而激活特异性的信号通路。货物蛋白通过一段短氨基酸序列(NLS)进行识别[7]。

　　亲核蛋白通过NLS识别importinα,与可溶性NLS受体importinα/importinβ异二聚体结合,形成转运复合物。在importinβ的介导下,转运复合物与核孔复合物的胞质纤维结合。转运复合物通过改变构象,从胞质面转移到核质面。转运复合物在核质面与RanGTP结合,并导致复合物解离,亲核蛋白释放。受体的亚基与结合的Ran返回胞质,在胞质内RanGTP水解形成RanGDP并与importinβ解离,RanGDP返回核内再转换成RanGTP形态[12]。图5 质谱鉴定GSTImportin α

　　生物大分子细胞核转运过程具有重要的医药学研究价值。真核细胞核孔的输入输出是直接联系胞浆与胞核的重要节点，它的输入输出速度以及效率直接影响到基因表达的效率。Importin α是NPC的重要组成部分，也是决定核孔输入输出这一过程的关键因素，一些病毒如HIV、HBV都是通过与Importin α的特异结合而完成其入核过程[13]。通过特异性抗体结合核孔复合物，能使该蛋白的作用得到抑制，不能和胞质内具有核定位信号肽的转运蛋白结合，从而达到靶向治疗的目的。因此，Importin α抗体的制备对于研究病毒、药物对基因表达影响等有重要意义。

　　本实验提取人肝癌细胞的mRNA，通过逆转录克隆Importin α基因，并构建重组质粒，诱导并纯化重组Importin α蛋白，利用纯化蛋白免疫小鼠，成功制备该蛋白的多克隆抗体，ELISA检测抗体效价达1∶1×105，通过免疫印迹实验证明该抗体具有高度特异性，本研究可制备大量纯化蛋白和多克隆抗体，为进一步探索Importin α的蛋白结构、生物学效应及其生物学作用机制提供了依据。

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