创伤痛大鼠痛阈的昼夜节律实验研究

【摘要】  目的 研究创伤痛大鼠痛阈的昼夜节律变化。方法 经过痛阈筛选的96只SD大鼠随机分为12组,每组8只,其中每2组作为1个观察时间点,分别于8:00(ZT0)、12:00(ZT4)、16:00(ZT8)、20:00(ZT12)、24:00(ZT16)、4:00(ZT20)这6个时间点用甩尾法测定动物痛阈后,分别在相应的时间点对动物进行处理:空白对照组(不截肢)、截肢模型组(截肢)。截肢后立即测定动物的术后痛阈,计算截肢前后的痛阈改变率。结果 正常大鼠痛阈具有明显的昼夜节律,明期痛阈较高,暗期痛阈较低;创伤痛大鼠痛阈明显降低,尤其以早晨8点左右痛阈下降明显。结论 痛阈具有明显的昼夜节律,研究结果可为临床选择手术时机等提供实验依据。

【关键词】  时间生物学;昼夜节律;痛阈

　Abstract:Objective To study whether pain threshold of rats suffering from traumatic pain has a conspicuous circadian rhythm.Methods Ninetysix rats chosen from pain threshdd exam were randomly divided into 12 groups,with 8 rats in each group.The pain threshold of every 2 groups of rats was evalucited using tailflick method on the observation time point of 8:00(ZT0),12:00(ZT4),16:00(ZT8),20:00(ZT12),24:00(ZT16),4:00(ZT20) respectioely.Then every 2 gvaups was divided into blank group[no amputation(AMP)]and AMP group.Then postoperative pain threshold was immediately determined after treatment.The changing nate of pain threshold betore and after treatment was caculated.Results Pain threshold of normal rats had a conspicuous circadian rhythm,with its crest value at around 4pm and valley value around 24pm,that meant pain threshold was higher on light time and lower on dark time.After the amputation,the pain threshold of the rat decreased obviously,especially at about 8am.Conclusion Pain threshold has an obvious circadian rhythm.This finding provides reference to selecting clinical operation time.

　　Key words:chronobiology;circadian rhythm;pain threshold

　　疼痛是多种疾病的共同病理表现,过强的疼痛或长期慢性的病理性疼痛,将引起机体产生一系列的生理病理改变。大量的临床和实验研究表明,在不同的时辰,机体对疼痛的反应性的高低并不是恒定不变的。我们研究了创伤痛大鼠痛阈的昼夜节律变化,现将结果报告如下。

　　1 实验材料

　　1.1 实验动物

　　选用SD大鼠(SpragueDawley rat,Inbred strain),清洁级合格动物,体重161.63 g±24.92 g,2月龄,雌雄各半,由成都中医药大学实验动物中心提供(合格证号:川实动管质第9号)。所有动物在实验前适应性驯养10天,进行痛阈筛选,其标准是:痛阐测定在5～15 s左右能引起甩尾反应者用于实验,凡痛阈值高于15 s或低于5 s者,表示动物反应迟钝或过敏,则不纳入实验对象。本实验所有纳入实验动物的平均痛阈为8.15 s±2.58 s.　　实验在成都中医药大学时间医学测试室进行,隔音、通风、恒温(22℃±1℃)、相对湿度60%～65%、自动光暗控制。所有动物均自由饮水摄食。驯养10天后用于实验。

　　1.2 主要器械及仪器设备

　　7360型疼痛甩尾痛阈测定仪(核定电压220 V,频率50 Hz,电流1.25 A,UGO BASILE S.R.L,Biological Research Apparatus,意大利)。

　　2 实验方法

　　2.1 动物分组及处理

　　2.1.1 动物分组

　　实验开始前,将经过痛阈筛选符合实验标准的96只大鼠分别称重后,将痛阈和体重作为双重选择指标,利用SPSS 12.0软件,将动物随机分为12组,每组8只,雌雄各半。其中每2组作为1个观察时间点,分别于6个相应的时间点对不同组的动物进行相应处理。所有动物提供8 am8 pm的人工光照,时间点分别为8am(ZT0,ZT即 zeitgeber time,为授时因子时间),12am(ZT4),4pm(ZT8),8pm(ZT12),12pm(ZT16),4am(ZT20)。

　　每次实验时注意控制声、光等因素的干扰。动物适应性驯养10天后,于实验开始的第一天8～12点内测定所有动物的痛阈作为基础痛阈;第二天在以上6个时间点分别对每16只大鼠进行痛阈测定,测得值作为相应时间点的术前痛阈;第三天进行动物处理,每个时间点的4个组的动物的手术及痛阈测定(术后痛阈)均同时开始进行。

　　2.1.2 动物处理

　　每个时间点的2组动物分别作以下处理。每个时间点的动物在同一时间点同时开始进行处理。空白对照组(简称空白组):不造模,于实验开始后与其他各组用同样的方法、同样的时间捆绑固定。动物总的固定时间为30 min.固定结束后立即测定痛阈。截肢模型组(简称截肢组):将大鼠固定于自制固定器上,固定10 min后行截肢手术,手术结束后继续固定动物,至总固定时间满30 min.固定结束后立即测定痛阈,测定痛阈完毕将动物放回笼内精心饲养。

　　2.1.3 造模方法

　　参照文献的方法进行:消毒右后肢皮肤,在踝关节下约0.5 mm处截断右后肢,缝合皮肤[1]。

　　2.2 痛阈测定方法

　　筛选动物时,基础痛阈测定在上午812点进行。纳入实验的动物,分别在相应的时间点1 h内进行痛阈测定。测定时均在同一室温条件下,分别在6个时间(08:00、12:00、16:00、20:00、24:00、04:00)对处理前后的动物的痛阈进行测定。测定痛阈时由固定人员测量动物甩尾反应潜伏期,所有动物均以流水编号进行痛阈测试。

　　本实验采用辐射热甩尾法测定痛阈[3],每个时间点测试时,所有动物按照流水号测定一次后,再按照流水号重复测定第二次、第三次,保证每只动物每次测试间隔均在10 min以上。取3次测定的平均值作为最后的痛阈。

　　处理前后2次测定共得到两个痛阈值,分别称为术前痛阈和术后痛阈。以痛阈变化率作为衡量针刺抗创伤痛的效应的指标之一。痛阈变化率=(术后痛阈术前痛阈)/术后痛阈×100%.

　　2.3 统计学处理

　　统计分析采用SPSS 12.0软件进行,另外,所有数据还采用Halberg余弦法进行生物节律分析[4]。

　　3 结果

　　3.1 截肢手术前后大鼠痛阈的总体变化情况

　　将95只纳入实验的大鼠(驯养过程中1只大鼠死亡),分别于实验前、后分6个时间点测定其在相应时间点的痛阈,计算其痛阈变化率。截肢、电针后,在相应时间立即测定大鼠痛阈,结果见表1及图1。表1 截肢手术前后不同时间点动物痛阈变化比较表2 空白对照组截肢手术前后24小时动物痛阈节律变化比较表3 截肢模型组截肢手术前后24小时动物痛阈节律变化比较　　　图1 处理前24小时周期所有大鼠不同时间点全部大鼠痛阈变化的折线图

　　3.2 空白对照组大鼠实验处理前后痛阈的昼夜节律变化情况

　　对截肢手术前后空白对照组大鼠各时间点的痛阈利用Halberg余弦软件单个余弦法程序进行余弦函数拟合,并分别计算其P值(P<0.05表示具有明显的节律性)、中值、振幅及峰相位,结果显示大鼠痛阈具有明显的昼夜节律,如表2所示。由于空白对照组的痛阈变化率没有明显变化,所以不对其作节律分析。截肢手术前24小时周期全部大鼠痛阈的极坐标图和余弦曲线见图2、图3.

　　从以上图表可以看出,空白对照组大鼠痛阈在实验前后的24小时周期中具有明显的昼夜节律,且与实验前的总体变化节律接近,均为白天痛阈高,夜间痛阈低,其中16点时最高,0点(24点)4点最低。图2 截肢手术前24小时周期全部大鼠痛阈的极坐标图和余弦曲线图　图3 空白对照组实验后24小时动物痛阈的极坐标图和余弦曲线图

　　3.3 截肢模型组大鼠截肢手术前后痛阈的昼夜节律变化情况

　　对截肢手术前后截肢模型组大鼠各时间点的痛阈利用Halberg余弦软件单个余弦法程序进行余弦函数拟合,结果见表3及图4～图6.创伤痛大鼠手术前痛阈节律与空白对照组类似。截肢模型组大鼠痛阈在实验前的24小时周期中具有明显的昼夜节律,与实验前的总体变化节律接近,均为16点时最高,0点(24点)～4点最低;实验后的痛阈和痛阈变化率均显示出一定的昼夜节律,提示创伤痛大鼠的痛阈仍然具有昼夜节律,其痛阈变化率也表现出较弱的昼夜节律(P值为0.049,与0.05接近),说明各时间点痛阈变化并不相同,出现明显的时辰差异。图4 截肢模型组截肢手术前24小时动物痛阈的极坐标图和余弦曲线图图5 截肢模型组截肢手术后24小时动物痛阈的极坐标图和余弦曲线图图6 截肢模型组截肢手术后24小时动物痛阈变化率的极坐标图和余弦曲线图

　　4 讨论

　　早在19世纪,人类就已发现疼痛反应具有昼夜节律性。大量的临床和实验研究表明,在不同的时辰,机体对疼痛的反应性的高低并不是恒定不变的。机体的痛阈具有明显的以24 h为周期的昼夜节律,如Li G等对小鼠的痛阈研究显示,夜间小鼠甩尾潜伏期更长(痛阈更高),且阿片受体拮抗剂纳洛酮(10 mg/kg,i.p.)可降低痛阈[2];Koch HJ等研究了13例2127岁健康受试者在 6点、12点、18点和24点4个时间点对止血带压迫所致疼痛的耐受性,研究显示,24点时对压迫性疼痛的耐受性最高[3]。而且随着疼痛、镇痛的基础和临床研究的逐渐深入,其对免疫功能的影响也越来越受到人们的关注。手术、创伤等对机体造成免疫功能的抑制已研究很多,这种疼痛及创伤等应激所造成的机体免疫抑制等效应,也具有明显的昼夜节律特征[4]。时间生物学研究表明,人及动物对疼痛的敏感性均存在时间节律性,而许多镇痛药物及镇痛手段的镇痛效应也具有时间节律性,如阿片类镇痛剂夜间的镇痛效应明显优于白天[5]。我们的研究结果显示,正常大鼠痛阈具有明显的昼夜节律,其峰值在白天12点16点,谷值在夜间0点凌晨4点左右,即明期痛阈较高,暗期痛阈较低;创伤痛大鼠痛阈明显降低,尤其以早晨8点左右痛阈下降明显,这可为临床选择手术时机等提供实验依据。

【参考文献】
  　[1] 黄彰海,孙文颖,刘昱,等.创伤大鼠下丘脑背内侧核神经元放电变化及电针效应[J].第一军医大学学报,1996,16(1):911.

　　[2] ylka MJ,Shearman LP,Levine JD,et al.Molecular analysis of mammalian timeless[J].Neuron,1998,21(5):11151122.

　　[3] Gotter AL.A Timeless debate:resolving TIM's noncircadian roles with possible clock function[J].Neuroreport,2006,17(12):12291233.

　　[4] iyamoto Y,Sancar A.Vitamin B2based bluelight photoreceptors in the retinohypothalamic tract as the photoactive pigments for setting the circadian clock in mammals[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1998,95(11):60976102.

　　[5] Thresher RJ,Vitaterna MH,Miyamoto Y,et al.Role of mouse cryptochrome bluelight photoreceptor in circadian photoresponses[J].Science,1998,282(5393):14901494.