以激光共聚焦图像三维重建技术研究小胶质细胞与神经系统其他类型细胞的关系及相互作用

【摘要】  目的 观察小胶质细胞在静息和活化状态下与中枢神经系统其他细胞类型的空间位置关系和相互作用。方法 雄性C57BL/6小鼠,纹状体内注射秋水仙碱建立神经元损伤模型。采用免疫荧光染色,激光共聚焦和细胞三维成像技术进行形态学观察。结果 黑质致密部中脑脑片可见典型的多巴胺神经元形态,小胶质细胞呈典型的静息状态。静息状态下,小胶质细胞有多级分支,环绕星形胶质细胞的胞体;星形胶质细胞呈梭形,突起细长,细胞核较小。结论 小胶质细胞与神经元,髓鞘存在密切接触,与星形胶质细胞之间存在交互性连接。

【关键词】  胶质细胞;三维重建;激光扫描共焦显微镜;中枢神经系统

　【Abstract】 Objective To observe the spatiallocation and interaction of microglia and other cell types in central nervous system under resting and activation conditions.Methods Male C57BL/6 mice were used to set up the neurons damage model by striatum injection with colchicines.The morphological manifestation was detected by immunofluorescent staining,Laser cofocus light microscopy and cellular 3D reconstruction.Results The typical dopaminergic neurons were observed at substantia nigra pars compacta in midbrain brain slices.The microglia showed obvious resting state.The microglia with multistage branch and surrounding soma of astrocyte,meanwhile the astrocyte with spindle shape and small hyperchromatic nuclei were observed under resting conditions.Conclusion The close contact exists in microglia and neurons,myelin,interactive connection was exist in microglia and astrocyte.

　　【Key words】 Microglia;3 D reconstruction;Laser scanning confocal microscopy;Central nervous system

　　近年来对Alzheimer病(AD)和Parkinson病(PD)等神经系统退行性病变的研究证实,炎症在疾病的发生和进展中发挥了关键作用,在这些疾病中均发现显著的胶质细胞增生和炎性介质表达,如肿瘤坏死因子(TNF)α,白介素(IL)1β,IL6等;同时,多项临床试验表明,非甾体类抗炎药能显著降低AD和PD的发病率[1,2]。 神经系统炎症的一个典型特征即胶质细胞增生,包括小胶质细胞和星形胶质细胞的活化和增生。作为脑内的免疫细胞,小胶质细胞在各种中枢神经系统疾病中的作用越来越得到重视[3]。 小胶质细胞在正常情况下处于静息状态,监视周围环境中的危险信号,对脑内的病理变化非常敏感。在病原体侵入,出现外界物质,神经元损伤等情况下会迅速活化,从多分支状变为阿米巴样细胞,发挥吞噬功能,和(或)分泌一系列可溶性因子,包括细胞因子、氧自由基、趋化因子、脂肪酸代谢产物(如前列腺素)等[4]。

　　既往文献报道,在PD患者脑标本中发现黑质部位有小胶质细胞活化[5],其后的研究也在PD患者黑质中发现很多与炎症相关的因子,包括TNFα,IL1β,iNOS等[6]。起初曾认为小胶质细胞活化仅发生在DA神经元大量死亡后,是一个相对较晚出现的事件,但近年的研究发现,小胶质细胞在神经元损伤中发挥了重要作用,并非仅发生在PD晚期。在PD的实验动物模型中,MPTP,6OHDA,百草枯(paraquat)等都可以造成DA神经元的特异损伤,损伤初期即会诱发小胶质细胞的显著活化,并通过其分泌的物质加重神经元损伤;同时发现利用内毒素(LPS)直接活化小胶质细胞也能造成DA神经元死亡。这些研究结果提示小胶质细胞活化对神经元具有很强的损伤作用[4]。我们的研究发现纹状体和黑质(SNc)内神经元均有神经元死亡,鉴于小胶质细胞在神经系统炎症及损伤中的重要作用,我们采用免疫荧光共聚焦图像三维重建观察黑质纹状体系统内小胶质细胞与神经元,少突胶质细胞,星形胶质细胞的位置关系及相互作用,现将结果报道如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物及建立神经元模型

　　雄性C57BL/6小鼠,22～25 g,购于第三军医大学野战外科学研究所动物中心。将小鼠随机分组进行脑内定位注射。戊巴比妥麻醉小鼠,置于小鼠脑立体定位仪,切开头皮,以0.3%双氧水处理顶骨表面组织,暴露前囟(Bregma),以之为标准点,将微量注射器移动到下列位置:中线旁开2 mm,前囟前方0.26 mm,标记针头在顶骨表面的位置点,以针头在此点钻孔,以头骨表面为起始点,将注射器下降3 mm。秋水仙碱被溶解在生理盐水中(1 mg/ml),总体积0.5 μl,在2 min内注射到纹状体,留针5 min。对照侧以同样的坐标和同样的方法注射生理盐水。

　　1.2 形态学观察

　　药物注射1周后,以4%PFA经心脏灌注小鼠,取脑进行后固定和脱水。将含有SNc的中脑置于含4%PFA的0.1 mol/L PB(pH 7.4,4℃)后固定2～3 d,而后转移至4℃30%蔗糖0.1 mol/L PB溶液中,直至标本沉入瓶底。行冰冻切片,取大脑冠状面,厚度为20 μm,取含有纹状体和SNC的切片,保存于0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中。对免疫荧光,酪氨酸羟化酶(TH),髓鞘碱性蛋白(MBP),cd11b和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)作为一抗。根据不同目的采用针对性的荧光标记二抗,如异硫氰酸荧光素(FITC)或Cy3标记的抗兔,大鼠的二抗。凝集素(lectinFITC)直接与切片孵育(1∶2000,4℃过夜)。以激光共聚焦(德国Leica公司)采集图像后,利用Bitplane公司的imaris 5.0软件对图像进行三维重建，然后分别对红色和绿色通道上的图像进行处理,构建isasurface,并拼合图像。

　　2 实验结果

　　2.1 黑质致密部小胶质细胞与多巴胺神经元的空间关系

　　荧光显微镜观察发现,黑质致密部中脑脑片可见典型的多巴胺神经元形态,胞体较大,约15～25 μm,胞浆和轴突着色(图1A);小胶质细胞则呈典型的静息状态,胞体很小,突起纤细有多级纤细分支(图1B)。两个同视野图像重合后可观察二者的位置关系(图1C),由于图像为二维,无法识别二者是否有直接接触。因此对图像进行数字放大,选取一个包括4个多巴胺神经元胞体和3个小胶质细胞胞体(图1D)的典型视野,采用常规方法观察三维位置关系,即用图像分析软件中的切片功能,可以对任意点进行深度分析,在z轴(此处定义为深度轴)观察物体之间的关系。在所选的层面上,均有小胶质细胞和神经元的直接接触(图1E)。三维重建后,小胶质细胞的突起直接接触多巴胺神经元表面,而且接触点非常常见(图1F)。

　　2.2 纹状体小胶质细胞与少突胶质细胞的位置关系

　　利用同样的重建方法,观察了纹状体内小胶质细胞和其他类型胶质细胞的关系。首先以抗MBP抗体对纹状体内的髓鞘进行染色,以显示少突胶质细胞及其突起,同时染色cd11b,观察小胶质细胞与之的位置关系。首先在冠状面切片上,图2A为重建之前的图像,图2B为对红色通道重建的图像,显示小胶质细胞形态和分布,图2C为对两个通道重建并拼合的图像。可见髓鞘表面分布着密集的小胶质细胞,小胶质细胞突起环绕髓鞘束,并游走于髓鞘纤维之间,与之保持着密切接触。在白质纤维矢状面切面的脑片上,同样可以观察到同样的情况。图2D为未重建之前的图像,图2E为对红色通道进行重建的图像,图2F为对红色和绿色重建并拼合后的图像。共聚焦图像上观察到单个小胶质细胞突起形成的闭合圆环 (图2G箭头所示),在重建的图像中也可以看到(见图2E同样位置)。为鉴定是否此环路来自单个小胶质细胞,对这一区域进行三维重建,发现随着改变观察角度(图2H为45度角,图2I为15度角),可以清楚地辨别出这并非是同一小胶质细胞构成的突起环路,而是来自不同小胶质细胞的突起互相重叠造成的。以GFAP对星形胶质细胞免疫荧光染色与cd11b双标后重建,也可发现小胶质细胞与星形胶质细胞间的紧密联系(图2J～2L)。静息状态下,小胶质细胞有多级分支,环绕星形胶质细胞的胞体;星形胶质细胞呈梭形,突起细长,细胞核较小(图2L)。图1 小胶质细胞与多巴胺神经元的位置关系绿色通道显示多巴胺神经元,红色显示小胶质细胞。A、B、C为荧光显微镜下观察到的同一视野图像,A显示多巴胺神经元,B显示小胶质细胞,C为叠加的图像;D、E、F为同一视野图像,D为原始激光共聚焦叠加图像,未进行三维重建;E为最常用的观察位置关系的方法,切片法,在两个轴可以看到z轴的位置关系;F为三维重建后的图像

　　2.3 小胶质细胞活化对其他细胞类型的影响

　　秋水仙素纹状体内注射1周后,小胶质细胞体现典型的活化形态(图3):去分支化,呈椭圆形,细胞核与胞体变大,转化为脑内的吞噬细胞阿米巴状细胞,提示其活跃的吞噬行为。免疫荧光染色发现,较多小胶质细胞包裹髓鞘,并将其囊括入胞体(图3B,3C),髓鞘及纤维随之逐渐解体。抗GFAP抗体同时免疫荧光染色星形胶质细胞,也发现小胶质细胞活化的形态(图3E,3F),伴随星形胶质细胞反应性增生,胞体变圆变大,突起缩短,数量增加(图3E,3F)。活化后的星形胶质细胞的突起投射到小胶质细胞(图3E',3F'),而且包绕其胞体(图3E黑色箭头图2 小胶质细胞与髓鞘细胞和星形胶质细胞的空间位置关系红色通道均显示小胶质细胞,A、B、C、D的绿色通道显示髓鞘细胞;J、K、L的绿色通道显示星形胶质细胞。A、B、C为同一视野图像,来自神经纤维冠状切面:A为原始共聚焦叠加图像,B仅显示红色通道,C为两个通道同时显示。D、E、F、G为同一视野图像,来自神经纤维矢状切面:D为原始共聚焦叠加图像,E仅显示红色通道,F为两个通道同时显示,G为原始共聚焦红色通道图像,箭头示小胶质细胞闭合环路样结构。H、I为三维重建后放大的图像,前者为45度视角,后者为15度视角,90度角可见E,箭头示环路样组成部分并不在同一平面。J、K、L为同一视野图像,J为原始共聚焦叠加图像,K为绿色通道三维重建后图像,显示星形胶质细胞形态,L为三维重建后双通道叠加图像

　　A、B、C为同一视野图像,绿色显示髓鞘,红色显示小胶质细胞,D为原始共聚焦叠加图像;E为三维重建后叠加图像,F为E翻转后的图像,即E的后面观。D、E、F为同一视野图像,绿色显示星形胶质细胞,红色显示小胶质细胞,D为原始共聚焦叠加图像;E为三维重建后叠加图像,F为E翻转后的图像,即E的后面观。E'和F'分别为E和F的局部放大,白色箭头显示星形胶质细胞发出突起延伸到小胶质细胞表面,黑色箭头显示星形胶质细胞包裹小胶质细胞。G为四种颜色荧光同时叠加的图像,显示中脑黑质致密部。黄色为多巴胺神经元,绿色为毛细血管和小胶质细胞,红色为星形胶质细胞,蓝色为细胞核推测星形胶质细胞反应增生后可能发挥了炎症调节功能,与活化小胶质细胞相似,作为脑内的免疫细胞成分发挥作用。为进一步研究小胶质细胞与周围细胞的关系,采用4个荧光通道同时标记,即以lectinFITC染色毛细血管和小胶质细胞,红色(罗丹宁或cy3)染色星形胶质细胞,以cy5标记的二抗染色多巴胺神经元,最后以Hoechst染色所有细胞核,共标结果显示这是可行的(图3G)。

　　3 讨论

　　在荧光显微镜下所采集图像提供的均为二维信息,只能用于观察二者是否有共定位,而很难分析观察目标三维空间的位置关系。激光共聚焦则可通过断层扫描的方法对切片进行逐层扫描,获得不同层面的二维信息,使对切片进行三维重建成为可能。Bitplane的Imaris系列模块是生命科学领域中的显微图像分析中,多维图像处理和分析的主导软件,是目前最方便的三维细胞结构生物显微影像分析处理软件[7]。对切片进行分层,分通道扫描后,可以直接导入imaris软件,进行图像分析。我们主要利用其三维成像的功能观察小胶质细胞与中枢神经系统其他细胞类型的位置关系。

　　小胶质细胞作为中枢神经系统抵抗炎症的第一道防线,负责清除死亡细胞,并在遇到危险信号的时候,招募T细胞,表达免疫球蛋白分子和补体受体,其突起处于动态变化中,不断对环境进行检测,为大脑提供了一道有效的预警系统[8,9]。我们的研究结果与此一致:在静息状态下,小胶质细胞与神经元、髓鞘和星形胶质细胞有紧密的、直接的接触。但我们的结果对小胶质细胞与其他细胞的联系提供了更加详细、精确和直观的描述,这为研究不同神经元对炎症易感性,不同疾病或损伤状态下小胶质细胞的不同功能,以及脑内不同结构小胶质细胞密度提供了新的手段和视角。

　　众多证据提示星形胶质细胞和小胶质细胞互相影响,以协同的方式处理来自外界和内环境中的信息。有关小胶质细胞和星形胶质细胞相互作用,在AD中体现得尤为明显。在AD病变中,小胶质细胞在老年斑中富集,周围同样有很多星形胶质细胞。小胶质细胞对损伤因素非常敏感,通过释放细胞因子(如IL1beta,TGFbeta,TNFα),有毒物质或增加吞噬功能,来维持内环境稳定。由于小胶质细胞自身表达这些细胞因子的受体,而星形胶质细胞在细胞因子刺激下,也表达一些细胞因子,如集落刺激因子[10],促进其增生,这样小胶质细胞和星形胶质细胞通过细胞因子进行交流,形成胶质细胞自分泌或旁分泌的调节模式[11]。Shih等[13]的研究支持这个观点,他们发现星形胶质细胞培养基能够显著降低小胶质细胞对氧化应激的反应,其机制是星形胶质细胞培养基通过活化小胶质细胞内的转录因子Nrf2,促进抗氧化应激基因的表达,从而降低氧化自由基的产生。这个调节途径作为一个反馈抑制来防止小胶质细胞产生过多氧化自由基,从而减少对神经元的非特异损伤[12,13]。

　　虽然以上的证据都表明星形胶质细胞和小胶质细胞之间存在信息的交流,但都没有关注二者之间相互影响的具体过程和方式,仅认为通过旁分泌的方式相互影响。在中枢神经系统的局部组织,各种类型的细胞空间位置需要严格按照其结构和功能进行排列,即便作为分泌细胞的胶质细胞,其空间位置关系必定与其功能紧密相关。我们三维重建的图像提示二者之间的密切接触很可能是其发挥功能的活跃部位。如果某些信息需要星形胶质细胞和小胶质细胞直接接触才能传递,这种信息传递的结构就非常类似于突触(神经突触、免疫突触)。基于这些信息,我们很粗略地提出一个假说:星形胶质细胞和小胶质细胞之间信息交流可能由一种我们称之为胶质突触(interglial synapse)的结构来介导(图4),作为一种特化的结构,介导不同功能状态下二者的信息交流。但必须承认,这个观点仍是一个比较初步的假说,需要进一步的形态学和功能实验证据予以证实。

　　总之,我们的研究证实了激光共聚焦逐层扫描和三维成像技术结合的巨大优势,通过三维成像能更加清晰和准确的把握组织中各种细胞间的空间位置关系,尤其对于神经系统,这种空间位置关系高度有序的结构,更适合用三维成像技术来研究其微观结构。虽然我们只采用两个颜色通道进行重建,但四个通道是完全可行的,甚至可以实现5～6个不同的荧光染料的同时染色。在这方面的探索有助于更加全面的分析组织中的细胞构成,相互联系和功能。免疫荧光、共聚焦显微镜和三维重建技术,极大扩展了组织学研究的领域[14],实际上,这些技术实现了组织学和解剖学的结合,利用组织学技术在微观尺度上对神经系统进行解剖,其应用前途非常广阔。图4 提出的假说星形胶质细胞与小胶质细胞相互接触,形成胶质突触。与其他类型中枢神经系统细胞不同,星形胶质细胞活化后不仅接受小胶质细胞的突起,还发出突起到小胶质细胞的胞体,这一位置的不同可能提示其功能的差别,星形胶质细胞很可能与小胶质细胞有交互联系,依赖特定的结构以实现信息的及时有效沟通,从而协同调节炎症反应

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