草酸钙晶体对大鼠肾小管上皮细胞损伤作用的实验研究

    Damage of calcium oxalate crystal to renal epithelial cells in rats

　　Li Chengwen, Sun Guang, Deng Yaoliang, Li Shengkuan, Mi Hua, Liu Deyun

　　(Department of Urology, The Second Affiliated Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300211;Department of Urology, The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, China)

　　ABSTRACT: Objective  To investigate the mechanism of nephrolithiasis by studying the damage of attached calcium oxalate crystals to renal epithelial cells in normal wistar rats and the subsequent changes in cystic function. Methods  Renal epithelial cells of normal rats were isolated and cultured respectively. On the fifth day of primary culture, culture media including oxalate ion (1, 3, 5mmol/L) and COM crystals (5mmol/L) were added to the cells of the experimental groups. Scanning electron microscopy (SEM) was used to investigate COM crystal attachment to renal epithelial cells after 8 hours. The activity of Na+ K+ ATPase and Ca2+ Mg2+ ATPase was also  determined spectrophotometrically. Results  There was no significant differences in cells Na+K+ATPase and Ca2+Mg2+ATPase activity between the oxalate group and the control group. However, there were apparent differences between the COM group and the control group. Conclusion  COM attachment on cultured Wistar rat renal epithelial cells can cause cell damage, which may lead to nephrolithinsis.

　　KEY WORDS: COM crystal; renal epithelial cells; damage

　　摘要：目的  通过研究一水草酸钙晶体粘附于体外培养的Wistar大鼠肾小管上皮细胞后引起的细胞功能变化，探讨尿路结石形成的机制。方法  分离、培养正常雄性Wistar大鼠的肾小管上皮细胞，在原代培养第5天时，将细胞分成3组(空白对照组，草酸组及一水草酸钙组)，分别加入正常培养液，含有草酸钠(1、3、5mmol/L)的培养液及含有草酸钠(1、3、5mmol/L)和一水草酸钙晶体(5mmol/L)的培养液，实验8h后利用扫描电镜观察一水草酸钙晶体对肾小管上皮细胞的粘附情况，并分别用比色法测定细胞的钙镁ATP酶和钠钾ATP酶的活性，观察比较细胞功能的变化情况。结果  实验8h后，扫描电镜观察提示一水草酸钙组中有大量一水草酸钙晶体贴附于肾小管上皮细胞表面。①在三个草酸梯度浓度中，草酸组细胞钙镁ATP酶和钠钾ATP酶活性均未见明显下降，与对照组无显著性差异(P>0.05)；②在三个草酸梯度浓度中，一水草酸钙组细胞钙镁ATP酶和钠钾ATP酶活性均明显下降，与对照组及草酸组有显著性差异(P<0.05)；③在不同草酸浓度的一水草酸钙组间细胞钙镁ATP酶和钠钾ATP酶活性无显著性差异(P>0.05)。结论  在高草酸环境下，对体外培养的Wistar大鼠的肾小管上皮细胞产生损伤作用的主要是一水草酸钙晶体而非游离草酸根离子。一水草酸钙晶体粘附于肾小管上皮细胞以后，可以造成细胞的损伤，这一机制可能有助于肾结石的发生。

　　关键词：一水草酸钙晶体；肾小管上皮细胞；损伤

　　一般认为，肾结石的形成是一系列化学的、生化的、生理的及分子调节等因素综合作用的结果\[1\]。尿液中草酸钙浓度的过饱和有助于晶体的成核和生长过程。但是，单个草酸钙晶体形成以后，只有粘附于肾小管上皮细胞的表面或者迅速地聚集形成较大的结晶以堵塞肾小管，否则，将被尿液迅速冲走，肾结石亦不会发生。钙离子和草酸的结合需要一定的时间，同时需要肾脏内一定尿流率的存在。因此，只有当草酸钙晶体粘附于肾小管上皮细胞表面以后，才有可能引发结石的形成\[2\]。新生的晶体粘附于肾小管上皮细胞表面后引发的细胞反应在肾结石的形成过程中发挥着重要的作用\[2\]。我们利用原代细胞培养技术，通过研究一水草酸钙晶体粘附于体外培养的Wistar大鼠肾小管上皮细胞以后，对细胞产生损伤作用的情况,以探讨尿路结石形成的机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  细胞培养及分组  健康Wistar雄性大鼠(体质量50-60g)28只，每组4只，共7组。戊巴比妥麻醉后无菌取肾去掉包膜，分离、剪碎肾皮质过筛网，获得肾小管节段，2g/L胰蛋白酶消化，短时离心，获得单个肾小管上皮细胞，加入含有10%新生小牛血清的RPMI 1640培养液，充分吹打混匀，分装在12孔板中，置于培养箱(37℃，5% CO2)中培养\[8\]。

　　1.2  实验方法  培养第5天细胞基本铺满孔板，去除培养液，对照组细胞加入正常培养液，每孔3mL，草酸组(共3组)细胞分别加入含草酸钠(1、3、5mmol/L)的培养液，每孔3mL，草酸钙组(共3组)细胞分别加入含草酸钠(1、3、5mmol/L)和一水草酸钙(5mmol/L)的培养液。实验8h后，电镜观察一水草酸钙晶体粘附到肾小管上皮细胞表面的情况，并分别用比色法测定细胞的钙镁ATP酶和钠钾ATP酶的活性。

　　1.3  统计学方法  实验数据经核实后，应用SPSS10.0 for Windows统计分析软件分析，结果用±s表示，均数的比较用t检验。

　　2  结果

　　细胞均于24-36h左右开始贴壁，48-72h后细胞开始生长，96h后细胞呈指数性增长，120h左右基本铺满孔板。实验进行8h后，扫描电镜观察可见大量的一水草酸钙晶体粘附于肾小管上皮细胞表面(图1)。各组细胞的钙镁ATP酶和钠钾ATP酶活性的结果(表1)比较显示：①在三个草酸梯度浓度中，草酸组细胞钙镁ATP酶和钠钾ATP酶活性均未见明显下降，与对照组无显著性差异(P>0.05)；②在草酸组中，不同草酸浓度的组间细胞钙镁ATP酶和钠钾ATP酶活性无显著性差异(P>0.05)；③在一水草酸钙组中，不同草酸浓度的组间细胞钙镁ATP酶和钠钾ATP酶活性无显著性差异(P>0.05)；④在草酸钙组中，三个草酸梯度浓度组的细胞钙镁ATP酶和钠钾ATP酶活性均明显下降，与对照组及草酸组均有显著性差异(P<0.05)。

　　表1  实验8h后各组细胞钠钾ATP酶、钙镁ATP酶的活性（略）

　　图1  实验8h后扫描电镜检查显示大量一水草酸钙晶体粘附于肾小管上皮细胞表面  ×5000（略）

　　3  讨论

　　尽管国内外的学者对肾结石的形成机制作了大量的研究，但是，草酸钙结石的形成机制至今尚未被阐明。一般认为，肾结石的形成是一个多因素参与的过程，这个过程包括尿液的过饱和、微小晶体的形成及结晶的生长和成熟等。其中，微小晶体粘附于尿路上皮细胞的表面被认为是肾结石形成过程中必需和关键的一个环节\[3\]。在本研究中，草酸钙组细胞加入一水草酸钙晶体8h后，扫描电镜检查结果提示确实已有一水草酸钙晶体粘附到大鼠的肾小管上皮细胞表面。这一结果提示，在肾结石的形成过程中，一水草酸钙晶体粘附到肾小管上皮细胞的表面可能发挥重要的作用。

　　新生的晶体粘附于肾小管上皮细胞表面后引发的细胞反应据认为在肾结石形成过程中发挥重要的作用\[2\]。Mary等利用培养的BSC1细胞系细胞进行研究时发现，一水草酸钙晶体粘附于BSC1细胞系的细胞表面后，编码cmyc、EGR1、Nur77、cjun、PAI1和CTGF等因子的基因表达都有不同程度的增加，而这些因子对原发性或继发性高草酸尿症病人肾间质的纤维化都起到很大的作用\[4\] 。

　　钙镁ATP酶、钠钾ATP酶是细胞膜重要的标志性酶，与细胞膜的转运功能密切相关，其损伤会引起细胞功能下降，甚至可引起细胞死亡。一些研究已经发现，草酸和草酸钙晶体可以对培养的肾小管上皮细胞产生损害作用，并认为这是促进肾草酸钙结石形成的一个危险性因素\[57\]。但是，在高草酸环境下，对肾小管上皮细胞产生损害作用的是草酸根离子还是一水草酸钙晶体？在这方面研究不多。本研究结果显示，在三个草酸梯度浓度中，草酸组细胞钙镁ATP酶和钠钾ATP酶活性均未见明显下降，与对照组无显著性差异；而在草酸钙组中，三个草酸梯度浓度组的细胞钙镁ATP酶和钠钾ATP酶活性均明显下降，与对照组及草酸组均有显著性差异。这一结果提示，体外培养的Wistar大鼠肾小管上皮细胞在草酸根离子浓度达到5mmol/L时仍未对细胞产生明显的损伤作用。在高草酸环境下，对体外培养的Wistar大鼠的肾小管上皮细胞产生损伤作用的主要是一水草酸钙晶体而非游离草酸根离子。一水草酸钙晶体粘附于肾小管上皮细胞以后，可以造成细胞的损伤，这一机制可能有助于肾结石的发生。

　　参考文献：

　　\[1\]Bigelow MW, Wiessner JH, Kleinman JK, et al. Calcium oxalate crystal attachment to cultured kidney epithelial cell lines \[J\]. J Urol, 1998,160:15281532.

　　\[2\]Lieske JC, Toback FG. Regulation of renal epithelial cell endocytosis of calcium oxalate monohydrate crystals \[J\]. Am J Physiol, 1993, F800F808.

　　\[3\]Bigelow MG, John H, Wiessner, Neil S, et al. Calcium oxalatecrystal membrane interactions: dependence on membrane lipid composition \[J\]. J Urol, 1996,155:10941098.

　　\[4\]Hammes MS, Lieske JC, Pawar S, et al. Calcium oxalate monohydrate crystals stimulate gene expression in renal epithelial cells \[J\]. Kidney Int，1995,48:501509.

　　\[5\]Schied C, Koul H, Narod JL, et al. Oxalate toxicity in LLCPK1 cells: Role of free radicals \[J\]. Kidney Int, 1996,49:413419.

　　\[6\]Scheid C, Koul H, Hill WA, et al. Oxalate toxicity in LLCPK1 cells, a line of renal epithelial cells \[J\]. J Urol, 1996,155:11121116.

　　\[7\]Thamilselvan S, Byer KJ, Hackett RL, et al. Free radical scarvengers, catalase and superoxide dismutase provide protection from oxalateassociated injury to LLCPK1 and MDCK cells \[J\]. J Urol, 2000,164:224229.

　　\[8\]Sikka  PK, McMartin KE. Normal rat kidney proximal tubule cells in primary and multiple subcultures \[J\]. BioAnim,1996,32:285291.

　　(编辑  雷立权)

　　通讯作者：孙光. Tel: 02288328603

　　作者简介：李成文(1974)，男(壮族)，广西百色人，在读博士，主治医师. Email: lichengwen1974@163.com   

　　(天津医科大学第二医院泌尿外科，天津  300211；广西医科大学第一附院泌尿外科，广西南宁  530021)