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【关键词】 簇蛋白；转化生长因子β1；凋亡
簇蛋白(clusterin)最早于1983年由Blaschuk等在鼠睾丸液中分离出来[1]。1987年，Leger等[2]在去势后的前列腺上皮细胞中发现一种凋亡相关基因TRPM2(testosteronerepressed prostate message2)。随后，实验证明了TRPM2所表达的蛋白就是clusterin[3]。但目前对于clusterin在前列腺细胞凋亡过程中的作用认识尚未清楚。本文观察clusterin在前列腺上皮细胞凋亡过程中的表达情况和部位，初步探讨clusterin的作用及与TGFβ1的关系。
1 材料与方法
1.1 标本来源 10只成年家犬(2-6岁)，购自天津医科大学实验动物部。将犬随机编号，按编号顺序分别于去势前及去势后15d内、15d后经腹腔行前列腺活检术。前列腺组织在10%(体积分数)甲醛溶液中固定后，以石蜡包埋组织备用。
1.2 主要试剂 一抗：clusterin(H330)兔抗人多克隆抗体和TGFβ1(sc146)兔抗人多克隆抗体均购自美国Santa Cruz生物技术公司；二抗：生物素化山羊抗兔IgG和三抗：辣根素标记链亲和素均购于中山公司。
1.3 免疫组织化学方法(ABC法) 用ReichertJung(德国)切片机切片，厚度为5μm。然后烤片后置于二甲苯中脱蜡，梯度乙醇至水，3%(体积分数)H2O2封闭组织生物酶。抗原修复后正常羊血清封闭10min，加clusterin一抗(稀释度1∶75)37℃孵育2h，二抗37℃孵育0.5h，三抗37℃孵育20min。各步骤间PBS漂洗，最后DAB显色。TGFβ1免疫组化同clusterin步骤。PBS代替clusterin和TGFβ1的一抗,作为阴性对照。
1.4 结果的判定标准 光学显微镜下(×400倍)计数每平方毫米的染色细胞的百分数。依染色细胞所占的百分数，将结果分为五个级别：-，+，，，。其中，-为阳性细胞数≤5%；+为≤10%；为≤20%；为≤40%；为>40%。
1.5 统计学分析 应用数据加权后秩和检验，分别对clusterin及TGFβ1的表达进行分析，P<0.05表示统计学上存在差异。对于clusterin与TGFβ1的关系，应用Spearman等级相关分析。
〖2〗现代泌尿外科杂志〖3〗第13卷
1期〖2〗王旭亮. 簇蛋白在前列腺上皮细胞凋亡中的表达和作用
2 结 果
2.1 簇蛋白在前列腺组织中的表达情况 clusterin在前列腺去势前几乎不表达(图1)，在去势后近期(<15d)表明明显增加，于去势后远期(>15d)又恢复至去势前水平。去势前与去势后近期存在统计学差异(P<0.01)，而与去势后远期无差异(P>0.05)，去势后近期与远期差异具有显著性(P<0.01，表1)。clusterin主要在去势后发生凋亡比较活跃的前列腺上皮细胞中表达，而前列腺基质细胞中仅有个别细胞表达(图2)。 表1 Clusterin在前列腺组织中的表达
2.2 TGFβ1在前列腺组织中的表达情况 TGFβ1的表达在去势前与去势后近期存在统计学差异(P<0.01)，而与去势后远期无差异(P>0.05)，去势后近期与远期差异具有显著性(P<0.01，表2)。表2 TGFβ1在前列腺组织中的表达
2.3 clusterin与TGFβ1的相关性 综合上面两表运用Spearman等级相关分析，clusterin和TGFβ1相关系数为0.706，P<0.01，存在相关性。
3 讨 论
关于clusterin在前列腺细胞凋亡过程中的作用，有学者认为clusterin阻止了细胞周期进展而促使细胞凋亡加速[4]，另外的观点认为clusterin在细胞内的堆积导致了细胞增生的减慢和诱导了细胞的凋亡[5]。虽然clusterin 的功能目前还不完全了解，但是无疑它的表达和前列腺细胞的凋亡有密切的关系。
我们的实验结果显示，clusterin在前列腺去势前几乎不表达，在前列腺去势后近期(<15d)，clusterin表达开始明显增加，达到高峰后在去势后远期(>15d)又恢复去势前的水平；clusterin基本表达在去势后发生凋亡比较活跃的前列腺上皮细胞中，而前列腺基质细胞中只有个别的细胞表达(图2)。这些结果表明：①clusterin的表达与前列腺的腺上皮细胞的凋亡有关；②去势后前列腺基质的退缩与clusterin的表达无关；③动态的来看，表达clusterin的细胞都多数是即将发生凋亡的细胞。
研究表明，clusterin作为一种外分泌蛋白，表现为一种膜稳定的作用，它的受体为细胞表面的gp330/megalin受体[6]。众所周知，细胞凋亡是一个主动的有序的需氧需能过程，而这个过程需要维持细胞膜和线粒体膜的完整性。而clusterin可能在维持这种膜稳定过程中起到重要的作用。因此假设，clusterin在和细胞表面受体结合以后，表现为一种细胞的膜稳定作用，但是这种作用不能阻止细胞内核酸内切酶的作用。在凋亡病变时，形态学表现为膜的损害轻而细胞核的损害重。clusterin的表达可能与凋亡过程中细胞膜病变轻有关。
因此，我们认为clusterin是前列腺上皮细胞凋亡病变过程中的一个效应分子，它在前列腺凋亡中没有实质性的功能。在细胞的凋亡早期，染色体尚未被破坏，凋亡细胞表达一系列的蛋白质包括clusterin。Clusterin的存在使凋亡细胞的细胞膜保持了完整，保证了凋亡过程继续进行。至染色体被内源性的核酸内切酶切断后，凋亡的过程已经不可逆，同时染色体的切断使clusterin的表达终止。
在研究中，前列腺上皮组织中表达clusterin的上皮细胞基本上都有TGFβ1的表达，且集中在凋亡活跃的分泌上皮的区域内。统计学分析证实了上述两种因子的表达存在一定的相关性。这说明TGFβ1 和clusterin是存在着一定的相互因果关系。有研究证实clusterin的表达受TGFβ的调控，而这种调控为涉及多个因子的复杂的过程 [7]。
综上所述，clusterin作为前列腺细胞调亡过程中的一个效应分子，受TGFβ表达的调控。
【参考文献】
\[1\]Blaschuk O, Fritz IB, Burdzy C, et al. Ram rete testis fluid contains a protein (clusterin) which influences cellcell interactions in vitro \[J\]. Biol Reprod, 1983, 28(2):11731188.
\[2\]Leger JG, Montpetit ML, Tenniswood MP, et al. Characterization and cloning of androgenrepressed mRNA from rat ventral prostate \[J\]. Biochem biophys Res Commun, 1987, 147(1):196203.
\[3\]Slawin K, Sawczuk IS, Olsson CA, et al. Chromosomal assignment of the human homologue encoding SGP2 \[J\]. Biochem Biophys Res Commun, 1990, 172(1):160164.
\[4\]Bettuzzi S, Scorcioni F, Astancolle S, et al. Clusterin (SGP2) transient overexpression decreases proliferation rate of SV40immortalized human prostate epithelial cells by slowing down cell cycle progression \[J\]. Oncogene, 2002, 21(43):43284334.
\[5\]Alessandro E, Maurizio S, Andrea C, et al. Cell detachment and apoptosis induction of immortalized human prostate epithelial cells are associated with early accumulation of a 45kDa nuclear isoform of clusterin \[J\]. Biochem J, 2004, 382(Pt 1):157168.
\[6\]Lakins J, Bennett SA, Chen JH, et al. Clusterin biogenesis is altered during apoptosis in the regressing rat ventral prostate \[J\]. J Biol Chem, 1998, 273(43):2788727895.
\[7\]Jin G, Howe PH. Transforming growth factor beta regulates clusterin gene expression via modulation of transcription factor cfos \[J\]. Eur J Biochem, 1999, 263(2):534542.(编辑 刘 华)
作者单位：杭州市第一人民医院泌尿外科，杭州 310006