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【摘要】 目的 研究调亡抑制蛋白Clusterin和Survivin在大肠癌组织和相应癌旁组织中的表达情况及意义。 方法 应用免疫组织化学法检测100例大肠癌癌组织和相应的癌旁正常组织的Clusterin和Survivin的表达情况，并进行相关的分析。 结果 Clusterin在大肠癌组织中其阳性率为67.0%，癌旁正常组织为18.0%，两者差异十分显著(P< 0.01)；Survivin在大肠癌组织中其阳性率为58％，癌旁正常组织为3％，两者差异十分显著(P < 0.01)；Clusterin和Survivin在大肠癌中的表达具有一定的相关性（r=0.225,P<0.01）。 结论 Clusterin和Survivin在大肠癌组织中具有较高的表达率在大肠癌中的表达呈正相关性，表明可能是大肠癌的生存基因，这为大肠癌的基因治疗提供了新的途径。
【关键词】 Clusterin； Survivin；大肠癌；基因治疗
The expression and significance of clusterin and survivin in colorectoal carcinoma patients.
CHEN Jin-yuan, LI Jie, XU Hong.
( Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 514043, Guangdong, P. R. China )
Abstract: Objective To investigate the relationship between the expression of clusterin and survivin in colorectal carcinoma patietns and its significance. Methods Immunohistochemical technique was used to detect the expression of clusterin and survivin in tissues of 100 colorectal carcinoma patients and adjacent normal tissues of 100 colorectal carcinoma patients . Their relationship and significance were investigated. Results The positive rates of clusterin in colorectal cancer and adjacent normal tissues of colorectal carcinoma patients were 67.0% and 18.0% respectively; The positive rates for survivin were 58 ％ tissues of colorectoal carcinoma and 3％ in the adjacent tissues, respectively; there was a positive relationship between the positive expression of Clusterin and Survivin in colorectal cancer .Conclusions The positive expression rates of clusterin and survivin in colorectal carcinoma patients were higher than adjacent normal tissues of colorectal carcinoma; Apoptosis of colorectal cancer was decreased by mutiple ways. The abnormal expression of clusterin and survivin showed that clusterin and survivin are survival gene of colorectal carcinoma patients.
Key words: Clusterin ; Survivin； Colorectal carcinoma; Gene therapy
调亡的调节对人体组织保持内环境稳态及正常细胞形态至关重要，这一过程受到干扰将使细胞的寿命无限延长或积累突变，有利于肿瘤的发生。Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族成员之一，是目前研究得比较多的一种抗调亡基因，Survivin在胎盘和胚胎组织中高水平表达，在正常组织中不表达，已经证实Survivin在许多肿瘤中过度表达[1，2]，但Survivin在大肠癌中的作用所知甚少。Clusterin是新近发现的一种重要的凋亡抑制因子，分子量为75kDa～80kDa，基因定位于8q21，含有大约1651个碱基，编码由448个氨基酸组成的蛋白质。Clusierin蛋白具有许多特征性的结构域，自然状态下人Clusterin蛋白由分子量均为40 000的两个亚单位组成异源二聚体，具有典型的信号肽结构，包含一个α亚单位和β亚单位。它普遍存在于人体组织细胞的胞浆蛋白，具有多种生物学功能，主要有脂质转运、辅助生殖、抑制补体介导的细胞免疫等。本实验通过检测Clusterin和Survivin在大肠癌中的表达研究其在大肠癌发生发展过程中的作用和大肠癌中Clusterin和Survivin表达的相关性，并探讨靶向Clusterin和Survivin治疗在大肠癌中的应用前景。
1 材料和方法
1.1 材料 收集广东医学院附属医院（2006，07~2007，07）来手术切除的大肠癌标本100例，所有标本均经病理学检查确诊。分别取肿瘤组织和癌旁正常组织（距肿瘤边缘5cm，病理学证实为正常组织）。每例标本切下后15min内冰下采集，置于-70℃冰箱保存。所有病例术前均未行化疗、放疗，有完整的临床资料与随访资料。其中男性62例，女性38例。年龄28－77岁，中位年龄59岁。结肠癌57例，直肠癌43例。病理类型：管状腺癌57例，乳头状腺癌29例，粘液腺癌14例。Duck,s分期：A期5例，B期38例，C期34例，D期23例。鼠抗人Clusterin单克隆抗体工作液(克隆号：41D)（编号：ZM-0285），兔抗人Survivin多克隆抗体工作液（编号ZA-0458），SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2方法 用PBS代替一抗作为阴性对照,用试剂赠送的阳性片作为阳性对照。免疫组化染色前均染色复查病理类型。
1.3 结果判定 每一批免疫组织化学检测标本均设有已知的阳性对照和用PBS代替一抗的空白对照。（1）Survivin主要定位于细胞质，有棕黄色颗粒沉着。光学显微镜下随机记测10个高倍视野中阳性细胞百分比：阳性细胞＜10％为－，10％－29％为＋，30％－59％为＋＋，60％以上为＋＋＋。（2）Clusterin阳性细胞见于细胞质显示棕黄色或棕褐色。光学显微镜下随机记测10个高倍视野中阳性细胞数。
1.4 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件进行相关分析。实验结果用±s表示，两因素间的差异比较采用x2检验，相关分析采用Spearman相关系数，检验水平为α=0.05，P＞0.05表示差异无统计学意义，P＜0.05表示差异有统计学意义，P＜0.01表示差异有明显统计学意义。
2 结果
2.1 Survivin在大肠癌中的表达以及与临床病理特征之间的关系 Survivin阳性染色主要定位于细胞质中，在大肠癌组织中的阳性率为58/100（58.0%），而癌旁正常组织中的阳性表达率为3/100（3.0%），两者差异十分显著(P<0.01)。Survivin的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小和组织类型之间均无明显关系，而与分化程度、临床分期和淋巴结转移之间有显著关系，见表1。
表1 Survivin蛋白表达与大肠癌临床病理特征之间的关系（略）
2.2 Clusterin蛋白表达与大肠癌临床病理特征之间的关系 Clusterin阳性染色主要定位于细胞质中，在大肠癌组织中的阳性率为67/100（67.0%），而癌旁正常组织中的阳性表达率为18/100（18.0%），两者差异十分显著(P<0.01)。Clusterin的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小和组织类型之间均无明显关系，而与分化程度、临床分期和淋巴结转移之间有显著关系，见表2。
表2 Clusterin蛋白表达与大肠癌临床病理特征之间的关系（略）
2.3 Clusterin和Survivin表达的关系 大肠癌组织中Clusterin和Survivin表达共同阳性45例，共同阴性20例。Clusterin表达阳性Survivin表达阴性22例，Clusterin表达阴性Survivin表达阳性13例。统计学相关性分析表明，Clusterin和Survivin在大肠癌组织中的表达呈正相关（spearman相关系数rs=0.255，P<0.01，表3），即随着大肠癌组织中Clusterin的表达率增高，Survivin也有高表达趋势。
表3 Clusterin、Survivin在大肠癌中表达的相关性（略）
3 讨论
多年来，人们一直以为细胞增殖和分化的异常是肿瘤发病的主要症结所在，然而随着细胞凋亡的概念的引入，人们开始从细胞凋亡的角度来审视肿瘤的发生。凋亡的调节对人体组织保持内环境稳态及正常细胞形态至关重要，这一过程受到干扰将使细胞寿命无限延长或累积突变，有利于肿瘤的发生。由此认为肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常的疾病，同时也是凋亡异常的疾病[1]。细胞的凋亡过程受凋亡促进因子和凋亡抑制因子的共同调节[2]，因此, 凋亡抑制因子的过度表达必然影响人体的稳定, 在癌症的发生、发展中起重要作用。Clusterin和Survivin就是目前研究得比较多的凋亡抑制因子。
Clusterin的功能包括调节细胞-细胞，细胞基质相互作用，参与脂类转运，参与生殖，细胞溶解，内分泌，补体介导和凋亡。最早于1983年在羊睾丸组织中分离得到，随后又发现该蛋白在人体的许多组织包括脑、心脏、肾脏、肝脏、肺脏、眼、乳腺、子宫、前列腺等器官中均有表达[2]。Sharou等[3]人的研究认为Clusterin是一种“粘附”蛋白，它的抑制细胞程序性死亡机制可能是直接通过与NTF分子的相互作用使靶细胞无法获得细胞因子。另一种可能是Clusterin在TNF的受体水平发挥作用。第三种可能是Clusterni与细胞表面分子(如鞘磷脂)相互作用，干涉TNF的信号转导。本研究结果证明大肠癌组织中Clusterni表达水平明显高于癌旁正常大肠组织，且Clusterni的表达与分化程度、临床分期和淋巴结转移之间有显著关系（P<0.01）；本研究发现随着肿瘤的进展，临床分期越晚，分化程度越低且伴淋巴结转移则Clusterni的表达水平也会逐渐增高，由此表明在大肠癌的恶变过程中，Clusterni通过抗细胞凋亡作用参与了大肠癌发生、发展甚至转移等的生物学行为。
Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族成员之一，被认为是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子,特异地表达于人和鼠的胚胎发育组织以及多数人类肿瘤细胞，在正常成人组织的表达仅见于胸腺、睾丸和分泌期子宫内膜，它的主要作用是抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞增殖[4]。此外，它还与肿瘤的化疗药物敏感性和预后有关。由于survivin表达的组织特异性及功能的多样性，使其成为肿瘤研究领域的一个新热点。Survivin的表达具有很强的细胞周期特性，在G2/M期表达明显增强[5]。抑制细胞凋亡的体外实验表明，survivin通过直接或间接干涉caspase的功能而抑制细胞凋亡。Survivin直接作用于caspase，主要是抑制easpase-3、Caspase-7的活性，阻断细胞的凋亡过程。Survivin也可通过P21间接抑制caspase，其机制是Suvrivin与细胞周期调控因子CDK4形成Survivin-CDK4复合体，使得P21从CDK4的复合体中释放出来，P21进一步与线粒体caspase-3结合，抑制其活性，阻止细胞凋亡[6]。
本实验结果表明大肠癌组织中的survivin表达水平明显高于癌旁正常大肠组织，癌旁正常大肠组织中几乎无阳性表达（3%）。随着大肠癌的不断进展，survivin的表达水平也逐渐升高，而高吴阳[7]也指出Survivin的表达随着肿瘤分级的增加、临床床分期的增加而相应增加。
肿瘤的形成和发展是一个多因素、多阶段以及长期相互作用的正常细胞恶性转化的过程。本实验发现Clusterni与Survivin在大肠癌组织中的表达呈正相关，Clusetrin与Survivin执行各自不同抗凋亡功能，这两条途径在抗凋亡作用上起协同作用，究其机制有待于进一步研究，是否二者表达受一个共同调控基因的影响尚不清楚。近50年来，尽管大肠癌的外科治疗技术迅猛发展，但是我国大肠癌的手术治愈率、5年生存率始终徘徊在50%左右（欧美发达国家为60%~62%），治疗失败的主要原因为局部复发率较高，越来越多的学者试图从凋亡途径来克服这个问题。
本研究发现作为生存蛋白Clusterni与Survivin其与大肠癌的生物学行为有密切的关系，可作为大肠癌的联合预后因子，而针对Clusterin与Survivin的靶向治疗在许多肿瘤模型中已经被证实具有可行性。如果封闭Clusterin和Survivin基因或者降低其表达能够介导细胞凋亡、抑制细胞增值，从而控制肿瘤生长，避免多药耐药以增加肿瘤细胞对化疗的敏感性，克服肿瘤细胞的耐药性，提高化疗的缓解率，那么Clusterin和Survivin就可以成为大肠癌基因治疗的新的生存基因。本实验试图通过探讨Clusterin和Survivin的表达与大肠癌的关系，为将来通过以Clusterin和Survivin为靶点进行基因治疗和临床新的抗肿瘤药物的研发提供理论基础，并为大肠癌的治疗提供新的解决途径。目前对于Clusterin和Survivin在肿瘤中的抗凋亡机制是否有决定性意义以及其抗凋亡作用在肿瘤发生发展过程中的相互作用方式还不是很明确，有待于进一步研究。
【参考文献】
［1］ Evan G,Littlewood T.Science,1998;281(5381):1317～1322.
［2］ Trougakos IP，Gonos ES．Clusterin／apolipoprotein J in human ageing and cancer［J］．In J Biochem Cell Biol，2002；34(11)：1430~1448.
［3］ Sharou M，Joseph SS，Janmes M，et al.Cytotoxic sensitivity to Tumor necrosis factor-a1Pha in PC3 and LNCaP prostatic cancer Cells is regulated by extracellular leve1s of SGP-2(clusterin) ［J］.prostate，1999，39(2):87~93.
［4］ Ambrosini G，Adida C，Altieri DC.A novel antiapoptosis gene，Suvivin，expressed in cancer and lymphoma［J］.Nature Med，1997(8):917~921.
［5］ Li F，Altieri DC. The cancer antiapoptosis mouse Survivin gene: charaeterization of locus and transcriptional requirements of basal and cell cycle-dependent expression.［J］ Cancer ReS，1999,59，3143~3151.
［6］ SuzukiA，hoT，Kawano H，et al.Survivin initiates Proeaspase3/p21 complex formation as a result of interaetion with CDK4 to resist Fas mediated cell death ［J］.Oneogene，2000，19(10):1346.
［7］ 高吴阳，胡传义，易慕华.Suvrivin蛋白在前列腺癌中的表达及其与肿瘤细胞凋亡的关系［J］.中华男科学，2004，1:12~14.
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